小鼠側(cè)腦室埋管給藥方法的優(yōu)化

趙 勇, 張 璐, 蔡麗萍, 徐 晨

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 上海 200433)

小鼠側(cè)腦室埋管給藥方法的優(yōu)化

趙 勇1, 張 璐2, 蔡麗萍2, 徐 晨2

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 上海 200433)

目的 優(yōu)化小鼠側(cè)腦室埋管給藥方法。方法 通過(guò)兩種不同埋管方法比較其成功率，通過(guò)不同注射劑量組死亡率觀察探索給藥劑量范圍。結(jié)果 實(shí)時(shí)糾偏埋管法成功率可達(dá)100%，側(cè)腦室注射劑量為5～10 μl時(shí)死亡率較低。 結(jié)論 實(shí)時(shí)糾偏埋管法成功率高于傳統(tǒng)埋管法，側(cè)腦室注射劑量建議范圍為0～10 μl。

C57BL/6J小鼠; 側(cè)腦室; 實(shí)時(shí)糾偏埋管法; 劑量范圍

采用腦立體定向儀對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行側(cè)腦室給藥是一種直接有效的實(shí)驗(yàn)方法, 目前已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)等的研究[1～3]。直接進(jìn)行側(cè)腦室給藥優(yōu)點(diǎn)顯著。首先, 能夠直接對(duì)研究區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的部位限制性給藥, 方便確切掌握給藥劑量和濃度; 其次能得出更接近正常生理狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

側(cè)腦室給藥通常有兩種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 一種是僅需單次給藥的實(shí)驗(yàn), 可以直接進(jìn)行側(cè)腦室注射; 另一種是需要連續(xù)給藥的實(shí)驗(yàn)，通常進(jìn)行側(cè)腦室埋管給藥的方法。采用側(cè)腦室埋管給藥方法的實(shí)驗(yàn)，能夠得到的可靠數(shù)據(jù)量與埋管成功率密切相關(guān)。小鼠的側(cè)腦室較大鼠小, 埋管成功率亦較低，很容易造成因埋管不成功而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)性，實(shí)驗(yàn)效率較低。這種無(wú)法實(shí)時(shí)調(diào)整、無(wú)導(dǎo)向、“盲目”的傳統(tǒng)埋管，往往需要靠成倍增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量來(lái)保證取得足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量，預(yù)防性的增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物量對(duì)實(shí)驗(yàn)資源和實(shí)驗(yàn)人員均造成無(wú)謂的浪費(fèi)。作者在長(zhǎng)期側(cè)腦室埋管實(shí)驗(yàn)中摸索出一種“實(shí)時(shí)糾偏埋管法”，即可以在埋管操作過(guò)程中對(duì)所埋套管是否進(jìn)入側(cè)腦室進(jìn)行判斷并實(shí)時(shí)調(diào)整，直至進(jìn)入側(cè)腦室為止，從而大幅提高側(cè)腦室埋管成功率。目前，關(guān)于側(cè)腦室給藥的劑量亦有爭(zhēng)議，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同注射劑量導(dǎo)致小鼠死亡率的比較，擬對(duì)小鼠側(cè)腦室注射時(shí)采用的藥物劑量范圍提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量22～26 g, 由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2008-0016], 飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施[SYXK(滬)2007-0003], 飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行:第一部分, 分為傳統(tǒng)埋管組和實(shí)時(shí)糾偏埋管組2組，每組10只，進(jìn)行兩種埋管法成功率比較; 第二部分，使用實(shí)時(shí)糾偏埋管法埋管，然后分為5、10、20、30 μl 四個(gè)注射劑量組，每組10只小鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

實(shí)驗(yàn)中使用ALC-H電動(dòng)數(shù)顯動(dòng)物腦立體定向儀、ALC-IP600型微量注射泵、ALC-CED8型動(dòng)物顱骨鉆(以上均由上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn))，埋置套管使用2.5 ml無(wú)菌注射器針頭自制，內(nèi)芯使用相配不銹鋼絲自制，與套管適配的PE管、內(nèi)注射針及直徑1 mm、長(zhǎng)度2 mm的固定用螺絲(購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。自凝牙托水和牙托粉均為市購(gòu)。實(shí)驗(yàn)用螺絲、套管等與小鼠體內(nèi)接觸器材采用新潔爾滅浸泡消毒。

1.3 手術(shù)方法

方法如下: (1)采用戊巴比妥鈉(濃度7.5 mg/ml)0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉小鼠; (2)小鼠頭頂部剃毛，固定于腦立體定向儀，調(diào)節(jié)門齒桿, 使其頂部呈水平狀; (3)頭頂皮膚消毒后沿中線切開, 剝離筋膜, 以無(wú)菌棉簽蘸少量雙氧水涂擦顱骨表面, 暴露Bregma(前囟)點(diǎn); (4)根據(jù)Paxinos等[4]所著《小鼠腦立體定位圖譜》選擇側(cè)腦室定位坐標(biāo)為前囟后0.6 mm, 旁開1.5 mm(本實(shí)驗(yàn)均為左側(cè)旁開), 深1.7 mm(進(jìn)針深度以硬腦膜為起始點(diǎn))(圖1); (5)操作腦立體定向儀使其定位在Bregma點(diǎn)，按所選取坐標(biāo)在顱骨頂標(biāo)記鉆孔位置, 使用0.8 mm直徑鉆頭鉆孔, 鉆孔以打通頂部顱骨且不傷及硬腦膜和腦實(shí)質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn); (6)在矢狀縫與人字縫交點(diǎn)右側(cè)約1.5～2 mm處鉆一淺孔(未鉆通顱骨)，留待固定螺絲; (7)傳統(tǒng)埋管法, 按照所選坐標(biāo)埋置套管至硬腦膜下1.7 mm處。實(shí)時(shí)糾偏埋管法, 將欲埋置的套管連接一段長(zhǎng)15～20 cm PE管(圖2)其內(nèi)充滿人工腦脊液或生理鹽水, 同樣埋置套管至硬腦膜下1.7 mm, 然后使PE管豎直，看其中液面是否有下降，下降即為進(jìn)入側(cè)腦室，若液面不下降則說(shuō)明未進(jìn)入側(cè)腦室，則可小范圍調(diào)整埋管深度，直至液面下降為止; (8)將螺絲固定于預(yù)留淺孔內(nèi)，使其與顱骨連接穩(wěn)固; (9)用牙托水和牙托粉將套管、螺絲、顱骨緊密粘合，凝固后松開固定套管的裝置, 輕柔取下PE管, 并插入套管內(nèi)芯;(10)顱頂撒入青霉素干粉，縫合皮膚切口; (11)小鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)1周。

1.4 判斷套管進(jìn)入側(cè)腦室方法

實(shí)驗(yàn)第一部分在套管埋置之后可以立刻用連接微量注射泵的內(nèi)注射針以2 μl/min的速度注射5 μl的0.1%溴酚藍(lán)染料, 靜置10 min, 抽出注射針，對(duì)小鼠施行安死術(shù)后取腦，沿進(jìn)針的冠狀面切開，若腦室內(nèi)充滿藍(lán)色染料，則說(shuō)明側(cè)腦室埋管成功，否則為不成功。

1.5 側(cè)腦室注射劑量設(shè)置

埋置套管的小鼠恢復(fù)1周后進(jìn)行第二部分實(shí)驗(yàn)即注射劑量研究。使用連接微量注射泵的內(nèi)注射針以2 μl/min的速度向側(cè)腦室注射人工腦脊液，注射量分別為5、10、20、30 μl，連續(xù)注射5 d后記錄小鼠存活率。

圖 1 套管埋置所在冠狀面

2 結(jié)果

2.1 兩種側(cè)腦室埋管法成功率比較

實(shí)驗(yàn)第一部分中，將體積分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍(lán)注入小鼠腦內(nèi)，若埋管位置正確，位于側(cè)腦室，則染料會(huì)經(jīng)由腦脊液循環(huán)到對(duì)側(cè)側(cè)腦室，甚至?xí)h(huán)至第三腦室。根據(jù)染料所染位置可以判斷是否埋管正確(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)糾偏埋管組10只小鼠全部埋管正確(成功率100%)，而傳統(tǒng)埋管組僅6只埋管正確(成功率60%)，證明實(shí)時(shí)糾偏埋管法優(yōu)于傳統(tǒng)埋管法。

2.2 注射劑量對(duì)小鼠存活率的影響

在連續(xù) 5 d進(jìn)行側(cè)腦室注射后, 5 μl和 10 μl劑量組小鼠死亡率均為10%(1/10), 20 μl劑量組死亡率為60%(6/10), 30 μl劑量組死亡率為100%(10/10)。

3 討論

圖 3 0.1%溴酚藍(lán)染料未進(jìn)入小鼠側(cè)腦室(左)與進(jìn)入側(cè)腦室(右)

腦立體定向技術(shù)是使用腦立體定向儀，根據(jù)顱骨表面標(biāo)志(如前囟、人字點(diǎn)、矢狀縫等)來(lái)確定腦內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)位置，對(duì)其進(jìn)行定向刺激、毀損、注射藥物、引導(dǎo)電位等的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)解剖[5]、生理[6]、藥理[2,7]和外科等領(lǐng)域。

很多基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)研究均采用側(cè)腦室注射技術(shù)，通過(guò)側(cè)腦室埋管連續(xù)進(jìn)行側(cè)腦室注射給藥的研究方法亦非常普遍。C57BL/6J小鼠被認(rèn)為是“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果精度高，可比性好，應(yīng)激反應(yīng)均一，在側(cè)腦室埋管技術(shù)中亦是種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究中[8～9]。小鼠的側(cè)腦室體積較小，采用傳統(tǒng)側(cè)腦室埋管方法成功率較低，通常有一部分小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)針痕驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)并未進(jìn)入側(cè)腦室，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不可用，浪費(fèi)了大量的時(shí)間、精力和經(jīng)費(fèi)。

有研究發(fā)現(xiàn), 在大鼠側(cè)腦室埋管時(shí), 可以通過(guò)緩慢抽出內(nèi)芯, 2～3 s后看是否有腦脊液流出的方法來(lái)判斷埋管位置正確與否[10]。經(jīng)實(shí)踐此法并不適用于小鼠, 即無(wú)法明確觀察到小鼠的腦脊液流出。但是可以觀察到連接套管的PE管內(nèi)液面是否下降, 因而此實(shí)時(shí)糾偏埋管法更加直觀。雖然此方法簡(jiǎn)單、直觀, 但在實(shí)際操作過(guò)程中還需注意以下問(wèn)題: ①有時(shí)雖然套管埋置位置正確，但是液面并不下降，可能是由于套管前段堵塞所致，可以在PE管開放端連接微量進(jìn)樣器，緩慢輕柔的進(jìn)行少量推注，則可疏通套管, 從而判斷埋管位置是否正確以及是否需要調(diào)節(jié)套管位置。②在推注微量進(jìn)樣器使液面下降過(guò)程中, 可同時(shí)觀察套管插入處的腦膜表面是否有液體溢出, 若有則可能是并未進(jìn)入側(cè)腦室。觀察液體溢出也是一個(gè)輔助判斷的觀察指標(biāo)。

在側(cè)腦室注射劑量實(shí)驗(yàn)中, 根據(jù)文獻(xiàn)大多數(shù)采用的劑量為 2～5 μl[11～12]，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)要求常需要更高注射劑量，小鼠的腦室容積約為30 μl, 因此本實(shí)驗(yàn)中劑量組分別設(shè)置為5、10、20、30 μl 4 組。5 μl和10 μl劑量組死亡率較低,說(shuō)明在側(cè)腦室注射實(shí)驗(yàn)中劑量可以低于10 μl。20 μl劑量組小鼠在第4日其狀態(tài)普遍較差, 第5日死亡量劇增(4只), 提示在必需進(jìn)行側(cè)腦室大劑量給藥時(shí)應(yīng)盡量縮短給藥天數(shù), 最好不要超過(guò)3 d; 實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)給藥速度較快則注射后小鼠狀態(tài)較差, 因而在必需大劑量給藥時(shí)建議減慢注射速度(如減至0.5 μl/min,0.25 μl/min)。30 μl劑量組死亡率100%，實(shí)驗(yàn)中盡量避免選用。

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)技術(shù)方法的優(yōu)化，采用的實(shí)時(shí)糾偏埋管法成功率高于傳統(tǒng)埋管法。在對(duì)小鼠側(cè)腦室注射時(shí)建議劑量范圍為0～10 μl。而實(shí)驗(yàn)中選取的側(cè)腦室注射液為人工腦脊液，其在滲透壓、離子濃度等各方面均接近生理值，即不易引起機(jī)體的各種不良反應(yīng)。實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中往往會(huì)注射滲透壓、離子濃度、甚至粘稠度各異的物質(zhì)，需根據(jù)實(shí)際情況對(duì)注射量和注射速度進(jìn)行調(diào)整。

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Q95-33

B

1674-5817(2014)02-0153-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.015

2014-03-04

上海市科委基金資助項(xiàng)目(12140900700)

趙 勇(1974-), 男, 講師,E-mail: zhaoyongslarc@163.com