熱休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纖維化過程中的作用

鄧麗麗, 臧家娜, 應華忠, 余陳歡, 俞 冰

(1. 淅江中醫(yī)藥大學藥學院, 杭州 310053; 2. 浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心, 杭州 310013)

熱休克蛋白70在兔非酒精性脂肪肝纖維化過程中的作用

鄧麗麗1, 臧家娜1, 應華忠2, 余陳歡2, 俞 冰1

(1. 淅江中醫(yī)藥大學藥學院, 杭州 310053; 2. 浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心, 杭州 310013)

目的 探討熱休克蛋白70(HPS70)在兔非酒精性脂肪肝(NAFLD)纖維化形成過程中的作用。方法 40 只雄性日本大耳兔隨機分為正常對照組和NAFLD模型組，其中對照組取8周為時相點，模型組取4周、6周、8周3個時相點，每個時相點各10只。模型組分別皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周，每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。按時間點處死各組動物，測定兔血清中ALT、AST、TC、TG、FFA、空腹血糖(FBG)、HSP47、HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN的含量和空腹胰島素(FINS)的水平，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR); MASSON染色觀察肝組織病理形態(tài)改變; 免疫組化觀察HSP47和HSP70的表達情況。結果 與對照組相比，模型組肝功能、脂質代謝和肝纖維化相關指標水平升高，造模4周時出現肝功能損傷，脂質代謝紊亂、胰島素抵抗，隨著NAFLD肝纖維化進程的發(fā)展，HSP70表達量逐漸增加。結論 HSP70的表達與NAFLD肝纖維化程度呈正相關，可能與NAFLD肝纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關。

非酒精性脂肪肝; 肝纖維化; 熱休克蛋白70; 胰島素抵抗

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床十大非傳染性疾病之一[1～2]。依據病變肝組織中是否伴有炎癥反應和纖維化，NAFLD可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化[3]，其中NAFLD肝纖維化作為NAFLD臨床病理發(fā)展過程中的一個亞型，是NAFLD進展為肝硬化、肝癌的必經階段[4]。肝纖維化的發(fā)生并不是一個單一因素參與的過程，而是一種多基因、多因素、多途徑共同參與的過程；這些因素互相影響、互相交叉，共同形成了一個復雜的網絡[5]。HSPs是一種免疫蛋白，它既能通過模式識別受體激活先天免疫系統(tǒng)啟動或促進炎癥反應，同時作為前膠原的“分子伴侶”，參與機體內膠原合成，是膠原成熟的必要條件，它的表達影響膠原的產量[6]，表明其可能與纖維化形成有聯系。據報道，HSPs家族的HSP47與HSP70都與形成多種纖維化有關，但與肝纖維化的相關研究尚未見報道。本實驗通過兔皮下注射花生油建立NAFLD模型，動態(tài)檢測兔NAFLD肝纖維化過程中HSP70在肝組織中的表達，以探討HSP70在肝纖維化發(fā)展中的作用，也為該模型在脂肪肝發(fā)病機制方面提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性日本大耳兔40只，體質重2.0±0.2 kg。由浙江省實驗動物中心提供[SCXK(浙)2009-0039];所有實驗均在浙江省實驗動物中心進行[SYXK(浙)2008-0114]。

1.2 實驗試劑、儀器

丙氨酸轉氨酶(ALT)試劑盒、門冬氨酸轉氨酶(AST)試劑盒、游離脂肪酸(FFA)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所; 兔生物指標ELISA試劑盒，均購于上海拜沃公司; 花生油(飽和脂肪酸: 單不飽和脂肪酸: 多不飽和脂肪酸=0.27∶1∶1)，購于東莞市鵬發(fā)糧油有限公司; 其余所用試劑均為分析純。723N型可見分光光度計，上海精密科技有限公司; DM2500型熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，萊卡儀器有限公司; 三諾安穩(wěn)血糖儀，長江三諾生物傳感技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及造模 將日本大耳兔隨機分為正常對照組和NAFLD模型組, 其中正常對照組取8周為時相點，模型組取4周、6周、8周3個時相點，每個時相點各10只。模型組分別皮下注射花生油4周、6周、8周，2 次/周, 每次1.2 ml/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。正常對照組隔天注射同體積的生理鹽水。

1.3.2 取材 各時相點動物均于末次注射后禁食12 h,耳動脈取血，速眠新麻醉后頸動脈放血處死。以3 500 r/min，離心10 min，分離血清-80℃下保存?zhèn)溆?。取同一部位肝組織裝于10%中性甲醛中固定，用于病理切片。

1.3.3 指標測定 采用血糖儀測定空腹血糖(FBG)，采用比色法測定血清ALT、AST、TC、TG、FFA含量。采用ELISA法測定血清中熱休克蛋白47(HSP47)、熱休克蛋白70(HSP70)、透明質酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)、胰島素(FINS)含量測定。具體操作步驟均按說明書進行。

胰島素抵抗指數(HOMA- IR)= FINS×FBG/22.5

1.3.4 病理學觀察 石蠟包埋肝組織標本制備4 μm切片, Masson染色, 光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.5 免疫組織化學分析 免疫組化觀察HSP47和HSP70在肝組織表達情況。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數據以x-± s表示，以SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，組間有差異用t檢驗，組間沒有差異用秩和檢驗。雙變量正態(tài)分布資料采用Pearson相關分析，不服從雙變量正態(tài)分布或等級變量資料相關性采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 血清生化指標的分析

與對照組相比較, 模型組各時間段血清中ALT、TC、FFA的值均升高, 有顯著性差異(P＜0.01),FBG、FINS、HOMA-IR在第4周出現升高，到第8周達到最大值，且顯時間依賴性(表1)。表明造模4周后出現肝功能損傷，高脂，胰島素抵抗，且隨造模時間的延長而加重。

各組兔肝纖維相關指標見表2。與對照組相比較，模型組各時間段血清中HSP47無顯著性差異，但HSP70、HA、PCⅢ、CⅣ、LN值顯著升高，且均具有統(tǒng)計學意義，表明模型組兔在造模4周后即發(fā)生明顯的纖維化，且隨造模時間的延長而加重纖維化程度。

2.2 肝組織病理形態(tài)觀察

肉眼觀察對照組兔肝臟無明顯異常，模型組兔第4周肝臟為色紅，質脆。6～8周肝臟被膜緊張、邊緣圓鈍、切面油膩、色淡黃，表面有花斑，質軟。Masson染色檢查，觀察到正常對照組兔肝組織結構正常，細胞核大而清晰，胞質豐富，肝細胞無變性、壞死，無膠原纖維。模型組4周兔肝組織呈輕度脂肪病變，部分肝細胞胞質內有大小不一的脂肪空泡，并在匯管區(qū)、匯管區(qū)周圍、纖維間隔內可見少量纖維組織增生(被藍染)，出現纖維化; 模型6周組兔肝組織細胞出現腫脹多于4周組，細胞核大小不均，被脂肪空泡擠向一側，纖維化擴展到門管區(qū)；模型8周組絕大部分肝細胞有脂肪空泡，纖維化擴展到門管區(qū)周圍，呈星芒狀放射(圖1)。表明隨著造模時間的延長，兔肝組織的纖維化程度進一步加重。

表 1 NAFLD肝纖維化兔血清生化指標的變化(n=10)

表 2 NAFLD肝纖維化兔血清肝纖維相關指標的變化(n=10)

2.3 免疫組織化學分析

HSPs表達物呈棕黃色顆粒，定位于細胞質中。對照組可見肝細胞質中有少量HSPs表達，其中HSP47的表達在不同時間相點模型中棕黃色分布幾乎相同(圖2)，表明HSP47在NAFLD肝纖維化進程中表達量無顯著性變化。而HSP70則隨造模時間的延長而棕黃色分布增多，顏色加深(圖3)，表明HSP70在NAFLD肝纖維化進程中表達量有顯著性變化，表達量逐漸增加。

2.4 相關性分析

分析實驗兔HSP47與HSP70對肝纖維化的影響。采用Image-Pro Plus 4.0分析軟件對NAFLD兔肝組織HSPs進行光密度值分析、多元線性分析[7～8],HSP70與HA、PCⅢ成呈正相關(P＜0.05)，與CⅣ和LN無相關性(表3)。而HSP47與肝纖維化指標均無相關性。以上結果表明HSP47與肝纖維化的形成發(fā)展無顯著影響，而HSP70與油脂誘導兔肝纖維化的形成有關。

表 3 HSPs與肝纖維化指標的相關性分析(n=40)

圖 1 兔肝組織病理學觀察(MASSON 染色, ×200)

圖 2 HSP47在兔NAFLD肝纖維肝組織表達情況(免疫組化×200)

圖 3 HSP70在兔NAFLD肝纖維化肝組織表達情況(免疫組化×200)

3 討論

3.1 皮下注射花生油造模

NAFLD肝纖維化動物模型的建立對研究肝硬化的發(fā)病機制、診斷和治療是重要的前提。目前，建立肝纖維化模型的方法主要有以下幾種: 四氯化碳(CCl4)誘發(fā)法、二甲基亞硝胺法、免疫誘發(fā)法、血吸蟲感染法，酒精誘導法、高脂飼料喂養(yǎng)誘導法。其中CCl4誘導的肝纖維模型應用最早、最廣泛，具有特性明確、形成性好，復制率高等優(yōu)點，但其實驗周期長，為8周到4個月不等，且死亡率高，與臨床NAFLD肝纖維化復雜的脂質調控機制相去甚遠; 同時，目前NAFLD研究最常用的大鼠模型在血脂代謝方面也與人類NAFLD特征有所區(qū)別[9～10]，存在高脂耐受的特點，極難形成肝纖維化，需連續(xù)高脂飼養(yǎng)6月以上方能少量形成NAFLD肝纖維化，存活率不足10%[11]。花生油是人們最常用的食用油之一, 具有熱量高, 脂肪量大等特點, 日本大耳兔對致病膽固醇膳食的敏感性高。本實驗選用花生油成功建立了肝纖維兔模型，成活率100%, 皮下注射花生油4周后兔肝組織MASSON染色呈輕度脂肪病變, 出現纖維化, 血清指標ALT、TC、FFA、HA、PCIII、CIV、LN值均顯著升高，伴有脂質代謝紊亂、胰島素抵抗等癥狀，到第8周已完全形成NAFLD肝纖維化。

與傳統(tǒng)方法比較，花生油皮下注射誘導日本大耳兔建立NAFLD動物模型，具有造模時短、肝臟取材量大，死亡率低、便于實時采血等優(yōu)點，可簡化實驗操作步驟，節(jié)約實驗成本。因此本實驗的造模方法為快速、可靠地篩選NAFLD藥物提供一種新的實驗工具。

3.2 NAFLD纖維化機制初步分析

熱休克蛋白(HSPs)是組織細胞受到外界因素刺激后應激產生的一種物質，是免疫應激和信號通路共同識別的生物標志物，在進化過程中具有高度保守性和同源性。以HSPs為中心的信號轉導通路是當今生物醫(yī)學研究領域中最活躍的主題之一，也是機體各種器官纖維化發(fā)生、發(fā)展及其復雜網絡調控過程中的關鍵靶點[12～13]，它既能通過模式識別受體激活先天免疫系統(tǒng)啟動或促進炎癥反應，同時作為前膠原的“分子伴侶”, 參與膠原合成, 是膠原成熟的必要條件, 其表達影響膠原的產量, 能引導效應因子與Wnt蛋白結合而開啟Wnt通路信號轉導[14]。

研究發(fā)現HSP47在各種器官膠原異常聚集的纖維性疾病中均有所表達增加，如肺纖維化、心肌梗塞、腎小球腎炎等[15～16]，提示HSP47與器官的纖維化疾病進程有一定相關性。本實驗結果顯示NAFLD肝纖維化的進程中HSP47的表達并沒有顯著性變化，反而HSP70表達逐漸增加，并且與HA、PCⅢ的含量隨NAFLD肝纖維化的進程增加的趨勢一致。提示在NAFLD肝纖維化中，HSP70作為主導作用促進HA和PCⅢ的形成而形成肝纖維化。同時HSP70又具有肝保護作用，國外研究顯示[17]，在急性肝損傷動物模型中HSP70對肝組織細胞有保護及再生的作用。因此可認為HSP70在NAFLD肝纖維化中既有保護肝細胞作用，又有促進肝纖維形成作用, 隨著造模時間的延長, 機體組織超出一定的恢復期，HSP70失去其保護作用, 其促纖作用占主導地位，加重肝纖維化。綜上所述，HSP70在NAFLD肝纖維化發(fā)展過程起重要作用, 可作為NAFLD肝纖維機制研究中的重要評價指標。

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Effect of HSP70 on Fibrosis of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rabbits

DENG Li-li1, ZANG Jia-na1, YING Hua-zhong2, YU Chen-huan2, YU Bing1
(1. Pharmaceutical College, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China;2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Zhejiang Center of Laboratory Animals, Hangzhou 310013, China)

ObjectiveTo investigate the change of HSP70 in nonalcoholic fatty (NAFLD) liver fibrosis of rabbit.MethodsForty male Japanese white rabbits were randomly assigned to control group and model group. The model group was divided into three subgroups, as 4-week, 6-week, 8-week groups, with 10 rabbits in each, and treated with peanut oil (1.2 ml/kg) subcutaneously (s.c.), twice a week for 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks respectively. The rabbits of all groups were sacrificed at the designed time point. Samples of serum were collected for detecting the serum ALT, AST, TC, TG, FFA,FBG, HSP47, HSP70, HA, PC?, C??, LN ,and the HOMA-IR were calculated. The liver tissues were collected for histopathological and immunohistochemical observation.ResultsThe model groups had hepatic injury and high level of insulin at the beginning of 4 weeks. With the process of NAFLD liver fibrosis, HSP70 had gradually increased.ConclusionThe expression of HSP70 was positively correlated with NAFLD liver fibrosis, and it might have close relation with the development of NAFLD liver fibrosis.

NAFLD; Liver fibrosis; HSP70; HOMA-IR

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0107-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.006

2013-10-30

鄧麗麗(1965-), 女, 碩士研究生, 從事疾病動物模型脂質代謝研究, E-mail: denglili485@sohu.com

俞 冰(1965), 女, 副教授, 從事疾病動物模型脂質代謝研究, E-mail: yhz0796@sina.com