滇楊多倍體的誘導(dǎo)研究

辛培堯 ，陳 杰 ，唐軍榮 ，田 斌 ，周 軍

（1.西南林業(yè)大學(xué) 國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；3.畢節(jié)市科技局 中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700）

滇楊Populus yunnanensisDode是楊柳科Salicaceae楊屬Populus青楊派（Tacamahaca）樹(shù)種，主產(chǎn)于云南、四川和貴州海拔1 300～3 200 m的山地。具有速生、耐寒、成材早，且易于無(wú)性繁殖等特點(diǎn)。滇楊為我國(guó)西南地區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹(shù)種，也是全國(guó)乃至世界少有的分布于低緯度高海拔地區(qū)的楊樹(shù)種質(zhì)資源。然而，滇楊具有易感染楊樹(shù)黑斑病、楊樹(shù)潰瘍病、易遭蛀干蟲害且分枝多的弊端，致使其優(yōu)良特性不能得到充分的利用[1-2]。目前，滇楊群體基本以雄株為主，雌株稀缺，遺傳資源相對(duì)較少，在一定程度影響著對(duì)滇楊不良性狀的遺傳改良。因此，有必要利用現(xiàn)有的遺傳育種手段，創(chuàng)育更多的滇楊種質(zhì)新材料，對(duì)其進(jìn)行有效的改良，充分利用其生產(chǎn)價(jià)值。多倍體育種是有效改良植物種質(zhì)的方法之一。由于基因劑量的增加，林木多倍體較其二倍體通常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)器官的巨大性，利用多倍體育種常能獲得優(yōu)質(zhì)、速生、高產(chǎn)及抗性強(qiáng)的林木品種，可大幅縮短用材林等的培育周期，提高單位時(shí)間和用地效率[3]。楊樹(shù)多倍體育種在我國(guó)雖然已取得了較多的成果，但有關(guān)滇楊多倍體的誘導(dǎo)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)利用已有的滇楊組織培養(yǎng)技術(shù)[4-6]，以滇楊葉柄為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)預(yù)培養(yǎng)后再與秋水素結(jié)合進(jìn)行分化培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)滇楊多倍體種質(zhì)，以期為滇楊乃至其他木本植物的多倍體育種工作提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的一年生滇楊枝條，將枝條剪成50～60 cm長(zhǎng)的莖段，摘除全部葉片后置于室內(nèi)水培，待其長(zhǎng)出新葉后剪下葉柄作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒

外植體的消毒采用辛培堯等[4]提出的方法。

1.2.2 預(yù)培養(yǎng)及多倍體誘導(dǎo)

采用辛培堯等[4]提出的方法，將消毒后的外植體首先接入普通分化培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3～7 d，再分別在附加有30 mg/L和40 mg/L秋水仙素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～3 d，而后轉(zhuǎn)入未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽，獲取變異植株。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)15種處理方法，并以不進(jìn)行任何處理的葉柄分化培養(yǎng)情況作為對(duì)照，每處理接種30瓶，每瓶接種葉柄4枚。在此過(guò)程中觀察性狀變異明顯的芽的數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和誘導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 30 mg/L和40 mg/L秋水仙素誘導(dǎo)培養(yǎng)方案Table 1 Culture formulas with 30 mg/L and 40 mg/L colchicine

1.2.3 多倍體叢生芽的“同質(zhì)化”

經(jīng)誘導(dǎo)后，表觀上具有多倍性的材料大多為“嵌合體”，需進(jìn)一步對(duì)這類材料進(jìn)行“同質(zhì)化”處理，以期得到倍性一致，性狀穩(wěn)定的多倍體材料。挑取生長(zhǎng)狀況良好，表觀上多倍化性狀突出的材料（表現(xiàn)為葉片變大變厚，莖段變粗變短）的莖段，剪為0.5～1.0 cm的小段，平鋪于分化培養(yǎng)基上[4]，稍做按壓，讓莖段與培養(yǎng)基充分接觸即可。待重新分化出的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)比較一致且能夠很好地觀察叢生芽性狀時(shí)，繼續(xù)挑選多倍化性狀良好的叢生芽，再次重復(fù)培養(yǎng)，直到新長(zhǎng)出的叢生芽性狀一致并穩(wěn)定。

1.2.4 增殖培養(yǎng)

切取上述性狀穩(wěn)定的叢生芽，接種在增殖培養(yǎng)基[5]上進(jìn)行增殖。

1.2.5 生根培養(yǎng)

經(jīng)試驗(yàn)，采用辛培堯等[5]提出的二倍體滇楊試管苗生根培養(yǎng)方案，對(duì)多倍化的滇楊材料進(jìn)行生根培養(yǎng)并不能獲得理想的效果。試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA和IBA，pH值為5.8～6.2。試驗(yàn)共計(jì)16個(gè)處理，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶5棵試管苗。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表2 滇楊多倍化材料生根培養(yǎng)方案Table 2 Rooting culture formulas of polyploid P. yunnanensis

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件均為溫度（25±2）℃、光照1 500～2 000 lx、光照時(shí)間14 h/d、相對(duì)濕度70%～80%。不定期用70%酒精噴霧殺菌降塵并定期用甲醛和高錳酸鉀對(duì)實(shí)驗(yàn)室及培養(yǎng)室進(jìn)行密閉熏蒸殺菌。

1.2.7 根尖染色體觀察

采用常規(guī)制片法壓片[7]，選取同質(zhì)化處理后多倍化性狀明顯且穩(wěn)定、一致的滇楊組培生根苗，截取其根尖進(jìn)行染色體數(shù)目的觀察，以確定其倍性，同時(shí)以其相應(yīng)的二倍體材料為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素誘導(dǎo)滇楊多倍體

消毒后的滇楊葉柄分別進(jìn)行3～7 d預(yù)培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移至添加秋水仙素的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在接入外植體的25 d前，具有明顯多倍體特征的叢生芽較少，25 d以后，目標(biāo)芽數(shù)量逐漸增多，可以觀察到葉片變大變厚、部分葉片卷曲、葉緣鋸齒變大、莖段變粗。觀察發(fā)現(xiàn)，在這一過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，芽分化的速度由慢變快，最后再趨于平緩。在附加有秋水仙素的培養(yǎng)基中，芽的誘導(dǎo)分化率明顯低于對(duì)照，這也說(shuō)明了秋水仙素對(duì)植物的毒害效果是比較明顯的。當(dāng)試管苗分化到第35 d時(shí)，不再出現(xiàn)明顯的芽分化。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并作方差分析（見(jiàn)表3）。

表3顯示，以30 mg/L秋水仙素為處理濃度時(shí)，不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，外植體在發(fā)芽率上存在顯著差異，CK在發(fā)芽率上保持了最高水平，為78.14%，由于其未附加秋水仙素，對(duì)材料沒(méi)有造成任何的毒害作用。在附加秋水仙素的處理組合中，3-1僅次于CK，發(fā)芽率為36.65%，其次為3-2和3-3（發(fā)芽率分別為35.25%和35.10%）；處理7-2和7-3發(fā)芽率較低，分別為30.30%和30.88%。叢生芽的變異率在不同的處理間也存在顯著差異。處理7-2變異率最高，達(dá)到了37.16%；其次為7-1和7-3變異比率均超過(guò)了30%，分別為30.23%和32.20%；處理3-1的變異率最低（僅為7.5%），而CK的變異率為0。由表3不難看出，隨著預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的增加，變異率有逐漸提高的趨勢(shì)。在誘導(dǎo)處理時(shí)間方面，處理2 d的組合其變異比率相對(duì)高于處理1 d和3 d的組合。由此認(rèn)為，在附加30%秋水仙素的培養(yǎng)基中處理材料時(shí)，2 d的處理效果優(yōu)于1 d和3 d。綜合誘導(dǎo)發(fā)芽率和誘變率可以看出，在30%秋水仙素的處理下，預(yù)培養(yǎng)7 d再誘導(dǎo)處理2 d，可以獲得較好的誘導(dǎo)效果，此明的發(fā)芽率為30.30%，誘變率為37.16%。

以40 mg/L為秋水仙素處理濃度時(shí)，處理3-1和3-2發(fā)芽率較高（為33.08%和32.83%，兩者之間無(wú)顯著差異；發(fā)芽率最低的處理為6-2，其發(fā)芽率僅為28.83%。隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)（表3）。表3還表明，附加40 mg/L秋水仙素進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，不同的處理對(duì)滇楊變異率的影響同樣存在顯著差異；變異率最低時(shí)為10.90%（處理3-1），最高時(shí)為50.96%（處理5-2）。從材料在附加秋水仙素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)處理不同時(shí)間的效果來(lái)看，處理2 d的所有組合其變異率均高于處理1 d和3 d的。同樣認(rèn)為在附加40%秋水仙素的培養(yǎng)基中處理滇楊葉柄時(shí)，2 d的秋水仙素誘導(dǎo)處理效果優(yōu)于1 d和3 d的。綜合誘導(dǎo)后的發(fā)芽率和誘變率可以發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)5 d，再在40%秋水仙素下誘導(dǎo)處理2 d，其誘導(dǎo)效果（發(fā)芽率為29.90%，誘變率為50.96%）優(yōu)于預(yù)培養(yǎng)7 d再在30%秋水仙素下誘導(dǎo)處理2 d的效果。因此，認(rèn)為，滇楊葉柄在未附加有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5 d，再在附加有40%秋水仙素的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)處理2天，是其多倍體誘導(dǎo)的較佳條件。

表3 滇楊多倍體誘導(dǎo)結(jié)果?Table 3 Polyploid induction results of P. yunnanensis

2.2 多倍體叢生芽同質(zhì)化培養(yǎng)

在同質(zhì)化培養(yǎng)的前5次中，具有多倍化性狀的組培苗個(gè)體之間生長(zhǎng)差異較大，常表現(xiàn)為同一個(gè)莖段或葉片上分化出來(lái)的叢生芽，粗細(xì)不一，芽高差異較大，葉片大小及葉卷曲不一；部分芽顏色差別明顯，常表現(xiàn)為粗壯的芽葉色墨綠，長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較細(xì)的芽葉色呈黃綠色。第6次培養(yǎng)時(shí)，葉片大小及莖段粗細(xì)差異逐漸趨同，多倍體芽數(shù)迅速增多，但仍存有部分差異過(guò)大的芽。對(duì)目標(biāo)性狀相當(dāng)明顯的叢生芽繼續(xù)重復(fù)分化培養(yǎng)到第8次，其多倍化性狀即可穩(wěn)定，并表現(xiàn)一致（見(jiàn)圖1）。

圖1 多倍化性狀穩(wěn)定的滇楊叢生芽Fig.1 Clustered shoots with stable polyploidy characters of P. yunnanensis

2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

對(duì)具有多倍性的增殖苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)過(guò)程中的生根率、平均生根數(shù)以及苗的生長(zhǎng)情況列于表4。

由表4可以看出，滇楊多倍化試管苗在不同濃度組合的IBA和NAA生根培養(yǎng)基上，其生根率差異顯著。生根率最高的培養(yǎng)組合為11及14（生根率為90%），且均與其他組合有顯著差異；組合3、7、10、12、15和16之間無(wú)顯著差異，生根率均為85%，生根率最低的為組合1，其生根率僅達(dá)到50%。多倍化植株平均生根數(shù)間差異顯著，生根數(shù)量最多的培養(yǎng)條件為組合11，其平均根數(shù)達(dá)到了6.6條。表現(xiàn)為生根數(shù)量多，且根毛也較多等性狀。組合15（平均生根數(shù)量為6.3條）與11（平均生根數(shù)量為6.6條）雖然在生根數(shù)上無(wú)顯著差異，但其生根率僅為85%，低于組合11（為90%），且生根后根毛較少。組合14雖生根率較高，但其平均生根數(shù)僅為4.6條。平均生根數(shù)最低的為組合1（僅為0.6條）。

表4 滇楊多倍體生根培養(yǎng)結(jié)果Table 4 Rooting culture results of polyploid P. yunnanensis

綜上，生根培養(yǎng)條件組合11（MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L）中，滇楊多倍化組培苗有較高的生根率及生根數(shù)，根毛較多，且幼苗生長(zhǎng)健康，葉色墨綠，因此認(rèn)為，該培養(yǎng)條件為滇楊多倍化材料誘導(dǎo)生根的較佳培養(yǎng)方案。

圖2 多倍化滇楊生根情況Fig.2 Rooting complexion of polyploidy P. yunnanensis

2.5 滇楊多倍化材料染色體數(shù)目的觀察

選取了10株性狀變異明顯的滇楊多倍化材料進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，并以二倍體材料為對(duì)照。結(jié)果表明，滇楊二倍體材料染色體數(shù)目為2n=2X=38（見(jiàn)圖3）；4株多倍化材料葉片近似圓形，染色體數(shù)目為2n=4X=76，可以判斷其為滇楊四倍體（見(jiàn)圖4）；另6株材料為較二倍體明顯變大變厚的菱形葉，且在同一根尖中發(fā)現(xiàn)了38條和76條染色體兩種細(xì)胞，初步判定其仍然為嵌合體。

圖3 滇楊二倍體細(xì)胞（2n=2X=38）Fig.3 Diploid cells of P.yunnanensis (2n=2X=38)

圖4 滇楊四倍體細(xì)胞（2n=4X=76）Fig.4 Tetraploid cells of P.yunnanensis (2n=4X=76)

3 結(jié)論與討論

（1）目前，利用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體是林木多倍體誘導(dǎo)中最常用的方法，誘導(dǎo)過(guò)程中常利用秋水仙素溶液處理種子及生長(zhǎng)點(diǎn)等，從而得到倍性變化的植株。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟，利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)多倍體逐漸被廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)在林木多倍體育種方面已經(jīng)有了較多的嘗試[8-14]。陳杰等[15]將滇楊葉柄首先直接在附加有10種不同秋水仙素濃度的分化培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)10～20 d，然后再轉(zhuǎn)接入未附加有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)。在80～90 mg/L的秋水仙素下，分別處理20～30 d，處理效果較好，但變異誘導(dǎo)率只達(dá)到16.18%。本研究首先是對(duì)葉柄進(jìn)行3～7 d的預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)培養(yǎng)，取得的更好的效果，變異誘異率高達(dá)50.96%。蔣巖峰[16]，李政等[17]分別在誘導(dǎo)南林895楊（Populus×euramericanacv.‘Nanlin895’）和綠玉樹(shù)多倍體時(shí)，均發(fā)現(xiàn)進(jìn)行一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，較直接分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，可明顯提高后期的變異誘導(dǎo)率。這與本研究的結(jié)果相一致。預(yù)培養(yǎng)使得外植體的細(xì)胞發(fā)生一定程度分裂活動(dòng)或者處于分裂旺盛時(shí)期，在此時(shí)期誘導(dǎo)分化，更利于得到加倍的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，從而獲得更多的誘變組織，提高誘變率。

（2）陳杰等[15]的研究發(fā)現(xiàn)滇楊多倍體植株在二倍體植株的生根培養(yǎng)基上生根效果不佳。對(duì)不同倍性的刺槐生根培養(yǎng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)問(wèn)題[18-19]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了16種多倍化滇楊生根培養(yǎng)條件，最終發(fā)現(xiàn)，MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L的條件下，滇楊多倍化組培苗的生長(zhǎng)和生根效果最佳。

（3）齊力旺等[20-22]以我國(guó)楊屬青楊派的9個(gè)代表性種為材料，對(duì)其染色體核型進(jìn)行分析后認(rèn)為，青楊派的核型較為穩(wěn)定，其染色體數(shù)目均為38，未發(fā)現(xiàn)天然多倍體。滇楊屬于青楊派樹(shù)種，試驗(yàn)對(duì)二倍體滇楊染色體數(shù)目觀察的結(jié)果為38，同時(shí)誘導(dǎo)獲得了染色體數(shù)目為76的滇楊四倍體材料。另外，還發(fā)現(xiàn)有部分植株在同一根尖中同時(shí)存在染色體數(shù)目為38和76的細(xì)胞，對(duì)于這類材料，有待于進(jìn)一步的同質(zhì)化處理，以獲得純合的滇楊多倍體種質(zhì)。

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