紫草素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究

陳武兵 金巧智 孫棟勛 蔡志毅

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國(guó)常見的頭頸部惡性腫瘤之一，主要發(fā)生在我國(guó)南方地區(qū)，近年來其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)。目前臨床主要以高劑量的放療聯(lián)合化療治療為主，但對(duì)于中晚期患者，預(yù)后仍不夠理想且不良反應(yīng)大，患者往往難以忍受，且易產(chǎn)生耐藥性［1～4］，因此迫切需要研究和開發(fā)高效低毒的新藥。紫草素即是從中藥紫草科植物紫草的根中提取的一種低分子萘醌類化合物，具有較廣的生物藥理學(xué)活性，大量醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，其可在多個(gè)層面上抑制多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［5］。

紫草素在對(duì)人宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、惡性黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡方面的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［6～9］。但是紫草素對(duì)于人鼻咽癌作用的相關(guān)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道甚少，所以本研究旨在探究紫草素對(duì)人鼻咽癌CNE－1細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移能力等生物學(xué)行為的影響，以期為進(jìn)一步研究紫草素抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)研究依據(jù)，初步探索紫草素治療鼻咽癌的可能性。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)材料:人高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE－1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);紫草素購(gòu)于Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗均為Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶－EDTA消化液、細(xì)胞凍存液、PBS緩沖液、Hoechst33258染色試劑盒、Annexin V－FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物公司;MTT試劑盒、抗熒光淬滅封片液購(gòu)自碧云天生物公司。

2．細(xì)胞培養(yǎng):CNE－1接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中(pH7．2)，在37℃、含5%CO2濕潤(rùn)空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24～48h換培養(yǎng)液，經(jīng)3次傳代穩(wěn)定后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3．紫草素培養(yǎng)液配制及實(shí)驗(yàn)分組:將粉末狀進(jìn)口紫草素先以1mg/ml的濃度溶于新鮮配制的培養(yǎng)液中形成母液，然后依次稀釋配制成1、5、10、15 μg/ml濃度的工作液，抽濾滅菌，4℃避光保存。實(shí)驗(yàn)分為無藥物處理組(對(duì)照組)和藥物處理組(實(shí)驗(yàn)組)。以下各實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的藥物濃度及作用時(shí)間均為預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選所得到的最佳作用濃度與作用時(shí)間。

4．利用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制法及MTT法，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。(1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE－1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種3×104細(xì)胞于0．5ml RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第2天開始，換液后分別在細(xì)胞中加入含不同濃度紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培養(yǎng)基 0.5ml，對(duì)照組使用不含紫草素的培養(yǎng)基，從第3天起，對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組每天收集4個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞用guava easyCyte 8HT流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)4天(第3天設(shè)定為d1，第4天為d2，第5天為d3，第6天為d4)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。然后以作用時(shí)間作為橫坐標(biāo)(即d0～d4)，以對(duì)應(yīng)每天的細(xì)胞數(shù)平均值作為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。(2)MTT法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(1×104個(gè)/毫升)，每孔100μl，常規(guī)培養(yǎng)12h，換液后分別加入含不同濃度的紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培養(yǎng)基 100μl，對(duì)照組培養(yǎng)基不含紫草素，繼續(xù)孵育48h，隨后每孔細(xì)胞加入10μl MTT試劑，作用4h后加入100μl formanzen溶解液，繼續(xù)作用4h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(D)。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。以對(duì)照組細(xì)胞的平均D值為100%活細(xì)胞數(shù)目，其他各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的平均D值分別與對(duì)照組細(xì)胞的平均D值相除，求出各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)目。最后，以相對(duì)活細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)、以不同濃度紫草素為橫坐標(biāo)進(jìn)行制圖。

5．熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×105個(gè)/毫升接種于放有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12h后換液加入含紫草素終濃度為5、10μg/ml的培養(yǎng)基1ml，作用48h后，參照南京凱基生物的細(xì)胞凋亡熒光Hochest33258試劑盒說明書進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察、攝像。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

6．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入紫草素1、5、10μg/ml，對(duì)照組不加藥物。分別培養(yǎng) 48h，收集培養(yǎng)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，70%乙醇(4℃預(yù)冷)固定細(xì)胞過夜，離心棄乙醇后用預(yù)冷的PBS洗滌2次，倒掉上清，每管加入PI染液，4℃染色30min后400目篩網(wǎng)過濾上機(jī)檢測(cè)，在流式細(xì)胞儀上用激發(fā)波長(zhǎng)EX=488nm，發(fā)射波長(zhǎng)EM=530nm測(cè)定各組細(xì)胞DNA含量的變化，利用計(jì)算機(jī)細(xì)胞周期分析軟件計(jì)算出各時(shí)相分布的百分比(%)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行4次。以增殖指數(shù)(proliferation index，PI)表示細(xì)胞的增殖活性，PI公式如下:

7．劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫草素對(duì)CNE－1細(xì)胞遷移能力的影響:在6孔板背面畫直線做標(biāo)記，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE－1細(xì)胞(5×105個(gè)/毫升)接種于做了標(biāo)記的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80% ～90%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS輕洗細(xì)胞2次后，用100μl移液器槍頭在培養(yǎng)孔的中央沿縱軸方向劃以直線(長(zhǎng)50mm，寬1．2mm)。用無菌PBS液輕洗細(xì)胞2次，以去除已被刮除的漂浮細(xì)胞。再向每孔中加入不同濃度紫草素(1、5、10、15μg/ml)，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，分別于 24、48h時(shí)于倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況并拍照。每組檢測(cè)5個(gè)視野，每組4個(gè)復(fù)孔，計(jì)算遷移率=(1－實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．紫草素抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE－1細(xì)胞增殖:流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖1，結(jié)果顯示，從第1天起，各濃度紫草素處理后CNE－1細(xì)胞生長(zhǎng)開始變慢。從第2天開始，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯變慢，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，且隨著濃度與時(shí)間的增加，其生長(zhǎng)抑制程度也逐漸加重。MTT 法測(cè)定結(jié)果如圖 2，1、5、10、15μg/ml紫草素分別處理CNE－1細(xì)胞48h后，CNE－1細(xì)胞的相對(duì)活細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01)，且與紫草素濃度呈遞降關(guān)系。

圖1 紫草素處理CNE－1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖2 MTT法檢測(cè)各濃度紫草素處理CNE－1細(xì)胞48h后的細(xì)胞增殖變化

2．紫草素處理后的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察:如圖3所示，經(jīng)Hoechst33258染色的CNE－1細(xì)胞對(duì)照組呈淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為亮藍(lán)色的核固縮和核碎裂呈分葉狀，其染色質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)凝聚，呈顆粒團(tuán)狀分布，有的核碎裂形成多個(gè)球形顆粒。

圖3 紫草素(1、5、10μg/ml)作用細(xì)胞24h后的Hoechst染色結(jié)果(×400)

3．紫草素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期的影響:經(jīng)不同濃度紫草素處理后，CNE－1的細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯的變化(表1)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(1、5、10μg/ml)的增殖指數(shù)分別為 56．32%、45．77%、35．04%，其中 5、10μg/ml組分別與對(duì)照組的58．64%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。同時(shí)這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的G0/G1期比例升高，S期比例降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞的比例隨濃度依賴性增大。而1μg/ml實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較細(xì)胞周期分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。細(xì)胞周期變化(%，x ± s，n=4)

表1 不同濃度紫草素作用CNE－1細(xì)胞48h的

4．CNE－1細(xì)胞的劃痕擦傷遷移實(shí)驗(yàn):如表2所示，培養(yǎng)細(xì)胞24h和48h后，CNE－1細(xì)胞發(fā)生遷移，對(duì)照組分別遷移了1．7、2．3μm，而加入不同濃度紫草素后，細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組明顯減弱，當(dāng)用15μg/ml紫草素作用CNE－1細(xì)胞24h時(shí)，細(xì)胞遷移率為23.5%，即紫草素對(duì)CNE－1細(xì)胞遷移抑制率達(dá)76．5%。

表2 不同濃度紫草素作用CNE－1后細(xì)胞遷移的距離變化

討 論

從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的中藥活性成分，是近年來抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)之一［10］。紫草素是中藥紫草的有效成分之一，體外研究發(fā)現(xiàn)紫草素能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡是不同作用機(jī)制的抗癌藥物發(fā)揮療效的共同途徑。本研究結(jié)果顯示，CNE－1細(xì)胞是一株分裂增殖旺盛的細(xì)胞。但經(jīng)不同濃度紫草素處理后，通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，顯示各濃度組紫草素對(duì)CNE－1細(xì)胞的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01)，提示紫草素在一定濃度范圍內(nèi)能顯著抑制CNE－1細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈濃度與時(shí)間依賴性趨勢(shì)。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種細(xì)胞程序性死亡，與腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)展密切相關(guān)，凋亡的抑制是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［1，11，12］。多數(shù)的抗腫瘤藥物都是通過激活凋亡通路引發(fā)細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療效果的［13，14］?？疾旌丸b定 CNE －1細(xì)胞經(jīng)紫草素誘導(dǎo)處理前后的細(xì)胞形態(tài)變化，是判斷細(xì)胞是否凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究通過Hoechst33258染色在熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，1、5、10μg/ml實(shí)驗(yàn)組中可看到較多的典型凋亡細(xì)胞特征:明顯的核仁減少、染色深、染色體濃縮、邊集，核裂碎，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀，并有凋亡小體形成。以上特征說明紫草素具有誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE－1細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。

細(xì)胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和分裂期(M期)，其失控可造成細(xì)胞惡性增殖［15］。其中G1期的長(zhǎng)短在很大程度上決定了細(xì)胞周期的長(zhǎng)短，即細(xì)胞增殖的速度。紫草素能否通過影響細(xì)胞周期的分布從而抑制CNE－1細(xì)胞增殖是本研究?jī)?nèi)容之一。本研究表明5、10μg/ml紫草素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯的變化，隨著濃度的升高，G0/G1期比例逐漸升高，S期比例逐漸降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期。同時(shí)5、10μg/ml組的增殖指數(shù)分別為45．77%、35．04%，與對(duì)照組的 58．64%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。提示紫草素可通過阻滯CNE－1細(xì)胞周期于G0/G1期來抑制細(xì)胞增殖分裂。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要惡性標(biāo)志，只有進(jìn)一步阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生才更有意義。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組劃痕處的空白未見明顯縮小，而對(duì)照組劃痕兩側(cè)的細(xì)胞已基本覆蓋了劃痕處的空白，且紫草素作用后CNE－1細(xì)胞遷移率明顯下降，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，表明紫草素能明顯抑制CNE－1細(xì)胞遷移。研究結(jié)果顯示，紫草素能體外抑制人鼻咽癌CNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)、阻滯CNE－1細(xì)胞周期于G0/G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移能力，使得紫草素有可能成為治療鼻咽癌的一種新型抗腫瘤候選中藥，同時(shí)也為鼻咽癌的臨床防治工作提供了重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

1 Chou J，Lin Y C，Kim J，et al．Nasopharyngeal carcinoma review of the molecular mechanisms of tumorigenesis［J］．Head Neck，2008，30(7):946－963

2 Zhao Y，Wang Y，Zeng S，et al．LMP1 expression is positively associated with metastasis of nasopharyngeal carcinoma:evidence from a meta －analysis［J］．J Clin Pathol，2012，65(1):41 －45

3 Cao JY，Mansouri S，F(xiàn)rappier L．Changes in the nasopharyngeal carcinoma nucler proteme induced by the EBNA1 protein of Epstein－Barr virus reveal protential roles for EBNA1 in metastasis and oxidative stress responses［J］．J Virol，2012，86(1):382 －394

4 Wang Y，He QY，Tsao SW，et al．Cytokeratin 8 silencing in human nasopharyngeal carcinoma cells leads to cisplatin sensitization［J］．Cancer Letter，2008，265(2):188 －196

5 Mao X，Yu CR，Li WH，et al．Induction of apoptosis by shikonin through a ROS/JNK mediated process in Bcr/Abl－positive chronic myelogenous leukemia(CML)cells［J］．Cell Res，2008，18(8):879－888

6 Zeng Y，Luo G，Yang WJ，et al．Inhibitory effect of acetylshikonin injection on human gastric carcinoma cell line SGC －7901［J］．Sichuan Journal of Physiological Sciences，2007，29(4):155－157

7 Guo YW，Wei XQ，Li YW，et al．Effects of shikonin on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells［J］．China Tropical Medicine，2008，8(8):1302－1304

8 Wu Z，Wu L，Li L，et al．p53－mediated cell cycle arrest and apoptosis induced by shikonin via a caspase－9－dependent mechanism in human malignant melanoma A375 －S2 cells［J］．J Pharmacol Sci，2004，94(2):166 －176

9 Han WD，Li L，Qiu S，et al．Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death［J］．Mol Cancer T －h(huán)er，2007，6(5):1641－1649

10 Hemalswarya S，Doble M．Potential synergism of natural products in the treatment of cancer［J］．Phytother Res，2006，20(4):239 －249

11 Hanahan D，Weinberg RA．Hallmarks of cancer:the next generation［J］．Cell，2011，144(5):646 －674

12 Georgi T，Pietro N．Dissecting the pathways of tumour escape:“ a question of life and death?”［J］．An Bras Dermatol，2010，85(2):248－259

13 劉延祥，張學(xué)武．中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(7):1563 －1565

14 Larmonier N，Merino D，Nicolas A，et al．Apoptotic，necrotic or fused tumor cells:an equivalent source of antigen for dendritic cell loading［J］．Apoptosis，2006，11(9):1513 －1524

15 Viallard JF，Lacombe F，Belloc F，et al．Molecu －lar mechanisms controlling the cell cycle:fundamental aspects and implications for oncology［J］．Cancer Radiother，2001，5(2):109 －129