星點設計－效應面法優(yōu)選湖北海棠葉總黃酮的提取工藝

郭東艷 王 幸 唐志書 汪鋆植

湖北海棠［Malus hupehensis(Pamp．)Rehd．］別名甜茶果、泰山海棠，為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物［1，2］。原產(chǎn)湖北省西部神農(nóng)架林區(qū)、宜昌、恩施等地，湖北海棠葉是湖北人常飲用的涼茶，也是土家族常用的藥物，收載于《湖北省中藥材質(zhì)量標準》(2009年版)，具有養(yǎng)肝和胃、生津止渴、消積化滯等功效，用于急慢性肝損傷、慢性肝炎、脂肪肝治療［3，4］。有關湖北海棠葉總黃酮文獻報道較少，因此本研究采用星點設計－效應面法優(yōu)選湖北海棠總黃酮的提取工藝，以期為今后的開發(fā)研究奠定基礎。

材料與方法

1．儀器:Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(G1311C型四元泵，G1329B型進樣器，G4212B型二極管陣列檢測器);UV－1102型紫外可見分光光度儀(上海天美科學儀器有限公司);GB－204型電子天平(瑞士);HH－2型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。

2．試藥:湖北海棠葉［購自湖北神農(nóng)架，經(jīng)陜西中醫(yī)學院王繼濤老師鑒定為蘋果屬(Malus Mill．)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp．)Rehd］的干燥葉。根皮苷對照品(自制，經(jīng)HPLC檢測含量＞98%);甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

3．湖北海棠葉中根皮苷的含量測定［6］色譜條件:Diamonsil C18(250．0mm ×4．6mm，5μm)色譜柱;乙腈 －0．05% 磷酸水(25∶75)為流動相;檢測波長為287nm;流速為:1．0ml/min;溫度為30℃。(1)對照品溶液的制備:精密稱取根皮苷對照品，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．015mg的溶液，備用。(2)供試品溶液的制備:精密移取湖北海棠葉提取液0．5ml于蒸發(fā)皿中于水浴上蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。線性關系的考察:精密移取根皮苷對照品溶液 2、4、6、8、10、12μl，依色譜條件進行測定，以根皮苷的含量(μg)為橫坐標，以測得的峰面積為縱坐標，計算回歸方程。(3)含量測定:精密吸取對照品溶液與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，外標一點法計算根皮苷含量。

4．湖北海棠葉中總黃酮的含量測定［6］:(1)對照品溶液的制備:精密稱取根皮苷對照品適量，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．1mg的溶液，備用。供試品溶液的制備:精密移取湖北海棠葉提取液1ml蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0．45μm微孔濾膜濾過，即得。(2)檢測波長的確定:分別取根皮苷對照品溶液和供試品溶液，按照紫外－可見分光光度法，空白試劑為50%甲醇，在選定的200～400nm波長范圍內(nèi)，分別對對照品溶液和供試品溶液進行全波長掃描。結(jié)果兩者均在287nm有最大吸收，因此將檢測波長定為287nm。

5．提取次數(shù)的考察:稱取4份湖北海棠葉約10．0g，分別加入10倍量70%的乙醇，水浴中回流提取1、2、3、4次，每次1h，濾過，將各濾液分別合并。以湖北海棠葉中根皮苷及總黃酮的含量為評價指標篩選提取次數(shù)。

6．星點設計－效應面法優(yōu)化提取工藝:采用星點設計－效應面法以回流提取法提取湖北海棠葉，以總黃酮及根皮苷的含量作為評價指標，對影響提取效果的主要因素乙醇濃度(X1)、溶劑用量(X2)、提取時間(X3)進行考察，從而確定回流提取的較佳工藝條件。

7．統(tǒng)計學方法:用SPSS 14．0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料用效應面分析法及方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．湖北海棠葉中根皮苷線性范圍的考察結(jié)果:以根皮苷的含量(μg)為橫坐標，以測得的峰面積為縱坐標，計算回歸方程為:Y=1745X+1．4467(R2=0.9999)，結(jié)果表明，根皮苷在 0．03 ～0．18μg的范圍內(nèi)線性關系良好。

2．湖北海棠葉中總黃酮的含量測定:(1)檢測波長的確定:通過對對照品溶液和供試品溶液進行全波長掃描，結(jié)果兩者均在287nm有最大吸收，因此將檢測波長定為287nm。(2)線性關系考察:分別精密吸取根皮苷對照品溶液 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0ml并移至10ml量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，即得。按紫外－可見分光光度法，以50%甲醇為空白，在287nm波長處測定吸收度。吸收度(Y)為縱坐標，根皮苷的濃度(X)為橫坐標，得回歸方程為 Y=30.274X+0．0055，R2=0．9993。結(jié)果表明，對照品溶液在0．005～0．03mg/ml濃度范圍內(nèi)與吸收度呈現(xiàn)良好的線性關系。

3．提取次數(shù)的考察結(jié)果:以湖北海棠葉中根皮苷及總黃酮的含量為評價指標篩選提取次數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 提取次數(shù)的考察(%)

結(jié)果表明，提取1次湖北海棠葉中總黃酮及根皮苷已基本提取完全，但為了避免試驗中因誤差造成總黃酮及根皮苷提取不完全，因此確定提取次數(shù)為2次。

4．星點設計－效應面法優(yōu)化提取工藝［7］:(1)以乙醇濃度(X1)、溶劑用量(X2)、提取時間(X3)為自變量，以湖北海棠葉中根皮苷(W1)及總黃酮百分含量(W2)的綜合評分為因變量，根據(jù)星點設計的原理，進行試驗設計。因素水平見表2，試驗設計及結(jié)果見表3。(2)模型擬合:采用 Design－Expert8．0．6軟件，以根皮苷及總黃酮百分含量的綜合評分對自變量進行回歸和擬合，結(jié)果表明，r=0．9974，各項方差分析結(jié)果見表4，簡化后的二項式方程為:Y=0．86+0.044X1－0．012X2+0．013X3－0．030X1X2+3．750 ×10－3X1X3+0.015X2X3－0.047X21+0.017X22+4．020 ×10－3X23，r=0．9956。說明 99．56% 總黃酮及根皮苷提取率的變差歸因于3個因素的變化，即只有0．44%的變差不被此方程所解釋。由表4的各個P值可以看出3個因素的線性效應都有較高的顯著性(P＜0．01)。擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。(3)工藝優(yōu)化與預測:固定其中一個因素值，繪制其中兩個因變量曲面圖(圖1～圖3)。在圖上選取較佳的工藝為:X1:68.88%，X2:8.54倍量，X3:148.2min。但考慮到實際的可操作性，修正工藝參數(shù)為乙醇濃度(X1):70%，溶劑用量(X2):8倍量，提取時間(X3):150min，并對其進行重復試驗。稱取湖北海棠葉50．0g，共3份，各加8倍量70%乙醇，提取2次，每次150min，平行制樣。依法測定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的工藝提取所得實測值與理論值接近，偏差在3%以內(nèi)。因此可將該提取工藝修訂為加入8倍量70%乙醇，提取2次，每次 150min。(4)驗證試驗:根據(jù)最優(yōu)工藝提取湖北海棠葉3份(每份500g)，依法測定總黃酮及根皮苷的含量，結(jié)果見表6。

表2 湖北海棠中總黃酮提取工藝星點設計因素水平表

表3 星點試驗設計與結(jié)果表

表4 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

圖1 乙醇濃度與提取時間對提取效果的影響

圖2 乙醇濃度與溶劑倍量對提取效果的影響

圖3 溶劑倍量與提取時間對提取效果的影響

表5 工藝優(yōu)化結(jié)果表

表6 驗證試驗結(jié)果(%)

討 論

近年研究表明，湖北海棠葉中主要含有茶多酚、黃酮、Zn、Cr、Mn等多種礦物質(zhì)等，其中黃酮類以根皮苷含量高，且易于提取分離。文獻［5～12］報道，湖北海棠葉中的總黃酮及根皮苷具有多種藥理活性，因此以總黃酮及根皮苷的含量作為湖北海棠葉提取工藝的評價指標，具有一定的科學性。

本試驗通過星點設計－效應面法優(yōu)選所得的最佳提取工藝為加入8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次。與筆者前期通過正交試驗優(yōu)選的結(jié)果稍有差異［5］(8倍量70%的乙醇，回流提取3次，每次1h)。為了驗證提取工藝的可行性，實驗中分別采用優(yōu)選的兩種工藝條件進行提取，并進行總黃酮及根皮苷的含量測定比較，結(jié)果兩種工藝提取出的總黃酮及根皮苷含量接近，8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次1h所得總黃酮及根皮苷含量較8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次的分別高3．2%和2.4%。關于大生產(chǎn)中工藝條件的選擇有待于通過總黃酮與根皮苷的提取率及生產(chǎn)成本進行綜合評價選擇。

1 方志先，廖朝林．湖北恩施藥用植物志［M］．武漢:湖北科學技術(shù)出版社，2006:446－447

2 中國科學院中國植物志編輯委員會．中國植物志［M］．北京:科學出版社，1974:379－380

3 朱靖靜，劉呈雄．湖北海棠質(zhì)量標準研究［J］．中藥材，2010;33(5):707－710

4 馮天艷，方榮，鄧改改，等．根皮苷對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用［J］．中藥藥理臨床，2010，26(5):47－49

5 王幸，師延瓊，覃鴻恩，等．多指標綜合評價法優(yōu)選湖北海棠葉中總黃酮提取工藝［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，18(13):46－49

6 李瑾．太白楤木保肝活性部位的制備及其制劑前研究［D］．西安:陜西中醫(yī)學院，2012

7 馮天艷，汪鋆植，周繼剛，等．湖北海棠葉總黃酮抗CCl4所致大鼠肝纖維化作用研究［J］．中藥藥理與臨床，2012，28(2):71－74

8 杜幼芹，馮天艷，鄧改改，等．湖北海棠葉總黃酮對日本血吸蟲感染小鼠肝纖維化的抑制作用［J］．中國血吸蟲病防治雜志，2011，23(5):551－554

9 馮天艷，方榮，鄧改改，等．根皮苷對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用［J］．中藥藥理臨床，2010，26(5):47－49

10 Jun ZW，Mi HC，BingJie X，et al．Estrogenic and Ant－iestrogenic acitivities of phloridzin［J］．Biol Pharm Bull，2010，33(4):592 －597

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12 薛冰潔，曹丹，周繼剛，等．湖北海棠總黃酮對成骨細胞增殖分化及破骨細胞活性的影響［J］．中國中醫(yī)骨傷科雜志，2011，19(5):12－14