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    石杉?jí)A甲對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)老年性聾的局部抗炎作用

    2014-01-03 12:54:26敖華飛阮清偉孔德秋
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2014年2期
    關(guān)鍵詞:施萬(wàn)石杉半乳糖

    顧 健 李 聰 敖華飛 阮清偉 孔德秋

    老年性聾又稱年齡相關(guān)性聽(tīng)力下降,主要指隨著年齡的增長(zhǎng),在排除噪音、耳毒性藥物和遺傳因素的參與情況下,聽(tīng)覺(jué)器官隨同身體其他組織器官一起發(fā)生的老化過(guò)程,主要表現(xiàn)為雙耳漸進(jìn)性對(duì)稱性的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失,以高頻聽(tīng)力下降為主,伴言語(yǔ)識(shí)別率降低等[1]。但迄今為止,老年性聾的防治仍然是尚未解決的難題,近年來(lái)最重要的進(jìn)展是認(rèn)同氧化應(yīng)激。石杉?jí)A甲素有“植物中的黃金”之稱,已經(jīng)在臨床上用于治療阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾?。?,3]。故本實(shí)驗(yàn)組擬通過(guò)注射D-半乳糖模擬機(jī)體衰老機(jī)制制備老年性聾模型,具體觀察石杉?jí)A甲是否具有局部抗炎作用。

    材料與方法

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí) SD雄性大鼠30只,體重為220~250g,購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,合格證編號(hào):[SCXK(滬)2009-0019]2009001918815,無(wú)噪聲暴露和藥物使用史,耳廓反射靈敏,電子耳鏡檢查外耳道、鼓膜均無(wú)異常。

    2.實(shí)驗(yàn)試劑:D-半乳糖(D-gal)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;石杉?jí)A甲(Hup A)購(gòu)于上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司(批號(hào):090504);小鼠抗人S-100單克隆抗體、NF-кBp65購(gòu)于Santa ckuz Biotechnology Inc公司。

    3.模型制備及分組:所選的SD大鼠在清潔安靜的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)平均分為3組,均行頸背部皮下連續(xù)注射8周。D-gal組給予5%D-半乳糖(200mg/kg);D-gal+HupA組予5%D-半乳糖(200mg/kg)和石杉?jí)A甲(0.1mg/kg)配成與模型組同體積溶液;對(duì)照組(control組)予以同體積生理鹽水。

    4.組織準(zhǔn)備:上述模型制備后將各組的SD大鼠經(jīng)戊巴比妥(80mg/kg)腹腔注射麻醉,開(kāi)胸后用4%的多聚甲醛行心臟灌注。后迅速斷頭,取出耳蝸,放入4%的多聚甲醛中固定,4℃過(guò)夜;常規(guī)行10%的EDTA脫鈣2周;后行梯度浸糖,先浸入15%蔗糖溶液,再浸入30%蔗糖溶液,至組織塊下沉。所有組織塊均在液氮中保存,在-20℃的恒冷切片機(jī)上以5μm連續(xù)冠狀切片,制作冷凍切片。

    5.免疫熒光染色:取各組不同SD大鼠的的冷凍切片置于室溫下30min,入4%的丙酮固定10min,0.01mol/L PBS漂洗5min×3次;用3%過(guò)氧化氫孵育5min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;再用0.01mol/L PBS漂洗5min×3次;10%羊血清封閉 30min,傾去不洗,滴加 1抗(1∶100),4℃過(guò)夜,次晨37℃復(fù)溫1h,PBS漂洗5min×3 次;滴加 2抗(1∶100),37℃孵育 60min,滴加 SABC 復(fù)合物(1∶100),37℃孵育30min,PBS 漂洗5min×3次,加DAB顯色5min,終止反應(yīng),雙蒸水充分洗滌,常規(guī)脫水、透明、封片。

    6.定量RT-PCR分析:總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA所需試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供。使用SYBR Premix RT-PCR試劑盒,根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行PT-PCR操作。引物序列列表見(jiàn)表1。

    表1 定量RT-PCR所用的引物列表

    7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)描述采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),采用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行組間比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.石杉?jí)A甲阻止施萬(wàn)細(xì)胞的激活、阻止NF-κB的活化:S-100標(biāo)記的施萬(wàn)細(xì)胞及NF-κB的免疫熒光染色如下圖1所示,由圖可知。3組大鼠耳蝸組織中S-100標(biāo)記的施萬(wàn)細(xì)胞和NF-κB增亮影基本重疊,說(shuō)明在膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB參與細(xì)胞的激活。與對(duì)照組(control組)比,D-gal組耳蝸組織中的施萬(wàn)細(xì)胞和NF-κB均高度顯色,說(shuō)明此時(shí)施萬(wàn)細(xì)胞被激活,同時(shí)NF-κB被活化,即D-半乳糖誘導(dǎo)形成的老年性聾耳蝸內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活。而D-gal+HupA組耳蝸組織中的施萬(wàn)細(xì)胞和NF-κB均正常顯色,說(shuō)明D-半乳糖誘導(dǎo)的老年性聾經(jīng)石杉?jí)A甲作用后耳蝸組織的施萬(wàn)細(xì)胞的激活被抑制。即表明石杉?jí)A甲具有阻止施萬(wàn)細(xì)胞激活和NF-κB的活化的作用。

    2.石杉?jí)A甲抑制D-半乳糖誘導(dǎo)老年性聾的局部炎癥反應(yīng):耳蝸組織中測(cè)定的IL-1β、IL-6、TNF-α的含量如下圖2所示。與對(duì)照組相比,D-gal組內(nèi)的IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與D-gal+HupA組相比,D-gal組內(nèi)的IL-1β、IL-6、TNF-α也明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 耳蝸組織中施萬(wàn)細(xì)胞、NF-κB p65免疫熒光

    討 論

    老年性聾是人體老化過(guò)程在聽(tīng)覺(jué)器官中的表現(xiàn),其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,至今還沒(méi)有統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制理論[4]。其中線粒體老化計(jì)時(shí)假說(shuō)最引人矚目,該理論認(rèn)為:線粒體氧利用率高,是活性氧的主要亞細(xì)胞來(lái)源,當(dāng)活性氧的產(chǎn)生和清除之間失去平衡,就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激[5]?;钚匝鯇?duì)生物大分子具有很強(qiáng)的破壞作用,可導(dǎo)致線粒體DNA、細(xì)胞等廣泛的損傷,內(nèi)源性抗氧化酶減少,線粒體膜穩(wěn)定性破壞,向細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C,通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,設(shè)法減少機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生、改善抗氧化防御和氧化損傷的修復(fù)功能,將大大提高老年性聾的防治水平。

    圖2 耳蝸組織中炎癥因子的RT-PCR

    石杉?jí)A甲(HupA)是從草藥蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體。因其具有易透過(guò)血腦屏障、口服生物利用度好、且持續(xù)作用時(shí)間更長(zhǎng)和外周不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn),目前已在臨床上用于阿爾茨海默病(AD)、重癥肌無(wú)力、精神分裂癥以及其他神經(jīng)退行性疾病。目前國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道石杉?jí)A甲有抗炎、抗衰老的作用。故本實(shí)驗(yàn)組就利用石杉?jí)A甲的此優(yōu)點(diǎn)研究其對(duì)老年性聾的局部抗炎作用[6,7]。

    在前期的實(shí)驗(yàn)中,筆者已經(jīng)通過(guò)檢測(cè)ABR對(duì)各組大鼠的各波潛伏期的變化進(jìn)行了觀察,D-gal+HupA組ABR閾值出現(xiàn)Ⅲ波潛伏期、Ⅰ~Ⅴ波間期縮短,聽(tīng)覺(jué)通路上神經(jīng)傳導(dǎo)加快,表明石杉?jí)A甲可以提高中樞對(duì)聲音的加工過(guò)程,進(jìn)而推斷這可能與改變軸突脫髓鞘變有關(guān)[8]。在本實(shí)驗(yàn)中為了進(jìn)一步探究此推斷。

    施萬(wàn)細(xì)胞是一種周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,為軸突提供支持并形成髓鞘,其功能極其活躍,可分泌多種活性物質(zhì),這些物質(zhì)對(duì)維持神經(jīng)纖維的存活、生長(zhǎng)及再生具有重要的意義。而NF-κB是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員,是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用,參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控,是細(xì)胞激活的標(biāo)志。NF-κB一般存在于靜息細(xì)胞中,在多種因素激活下進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA模板上的特意蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子。故本實(shí)驗(yàn)將石杉?jí)A甲的局部抗炎作用放眼于施萬(wàn)細(xì)胞和NF-κB是否激活受抑制,進(jìn)而說(shuō)明石杉?jí)A甲是否具有對(duì)局部神經(jīng)的抗炎、抗氧化作用。

    D-gal組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果即可顯示施萬(wàn)細(xì)胞的激活和NF-κB的活化是一致的,而D-gal+HupA組則明顯受抑制。即表明:石杉?jí)A甲具有抑制施萬(wàn)細(xì)胞的激活和NF-κB的活化。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探究了NF-κB依賴的炎性因子(如 IL-1β、IL-6、TNF-α)的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)一步說(shuō)明石杉?jí)A甲的局部抗炎作用。我們即可得石杉?jí)A甲阻止了施萬(wàn)細(xì)胞、抑制NF-κB的活化,繼而下調(diào)NF-κB依賴的炎性因子(如 IL-1β、IL-6、TNF-α)的表達(dá)。

    因此,石杉?jí)A甲對(duì)耳蝸組織的局部抗炎作用將有益于老年性聾的臨床治療,然而這一結(jié)論還有待于進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

    1 Seidman MD,Ahmad N,Bai U.Molecular mechanisms of age-related hearing loss[J].Ageing Res Rev,2002,1(3):331 -343

    2 Xiao XQ,Yang JW,Tang XC.Huperzine A protects rat pheochromocytoma cells against hydrogen peroxide-induced injury[J].Neurosci Lett,1999,275(2):73 -76

    3 Xiao XQ,Yang JW,Tang XC.Huperzine A and tacrine attenuate β -anyloid peptide induced oxidative injury[J].Neurosci Res,2000,61(5):564-569

    4 Mitchell P,Gopinath B,Wang JJ,et al.Five - year incidence and progression of hearing impairment in an older population[J].Ear Hear,2011,32(2):251 -257

    5 Moon H,Baek D,Lee B,et al.Soybean ascorbate peroxidase suppresses Bax-induced apoptosis in yeast by inhibiting oxygen radical generation[J].Biochem Biophys Res Commum,2002,290(1):457-462 6 Ruan Q,Liu F,Gao Z,et al.The anti-inflamm-aging and hepatoprotective effects of huperzine A in D -galactose-treated rats[J].Mech Aging Dev,2013,134(3 -4):89 -97

    7 Wang ZF,Wang J,Zhang HY,et al.Huperzine A exhibits anti- inflammatory and neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral is chemia[J].J Neurochem,2008,106(4):1594 -1603

    8 孔德秋,顧健,李聰?shù)龋級(jí)A甲對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)老年性聾大鼠聽(tīng)覺(jué)功能的影響評(píng)估[J].中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志,2013,93(19):199-203

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