響應(yīng)面法分析優(yōu)化生地黃提取工藝研究

曹 瑞 張 紅 師延瓊 鄭 蓓 崔春利 郭東艷

響應(yīng)面分析法(response surface methology，RSM)是一種篩選工藝比較好的方法，能篩選各個因素和因素與因素之間相互作用在工藝優(yōu)選中對評價指標(biāo)即響應(yīng)值的影響，可以表達(dá)因素和評價指標(biāo)之間的關(guān)系［1］。和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計不同，可以通過軟件擬合二項式模型，然后求得偏導(dǎo)數(shù)，得出較優(yōu)參數(shù)，可以較好的反應(yīng)出實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果表達(dá)［2］。目前，生地黃的提取多采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化考察，本實(shí)驗(yàn)引入中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選生地黃的提取工藝，旨在優(yōu)化水提取工藝的同時，為探討中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計－響應(yīng)面法應(yīng)用于中藥提取工藝的可行性提供依據(jù)。

材料與方法

1．材料與儀器:生地黃(西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，批號:111101)，蒽酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:20120701)，梓醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110808－200508)，葡萄糖對照品(20090201)，95%乙醇、濃硫酸均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸餾水。GB204梅特勒電子天平(瑞士制造);UV1102紫外分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司);日立L－2400型高效液相色譜儀(L－2130雙泵，L－2400檢測器，EZStart工作站);恒溫水浴鍋(HH－2型，北京科偉永興儀器有限公司)。

2．樣品中多糖與梓醇的含量測定:(1)多糖的含量測定:①對照品溶液的制備:精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖，加蒸餾水配制成每1ml含0．054mg的溶液，即得;②供試品溶液的制備:精密移取提取液0．5ml至100ml量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，即得;③顯色條件:加入新鮮配制的0．2%蒽酮試劑4ml，沸水浴15min，取出立即置冰水浴冷卻20min，即得。(2)梓醇的含量測定:①色譜條件:色譜柱:Thermo－C18柱(250mm ×4．6mm，5μm)流動相:乙腈 －0．1% 磷酸水(1∶99)，檢測波長210nm，柱溫30℃，流速1ml/min;②對照品溶液的制備:精密稱取對照品適量，加流動相制成每1ml含0.154mg的溶液，即得;③供試品溶液的制備:精密移取提取液1ml，加蒸餾水定容至100ml量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

3．單因素試驗(yàn)考察:(1)提取時間考察:分別稱取生地黃飲片50g，加10倍量水，煎煮2次，煎煮時間分別為30、60、90、120、150min，過濾，合并濾液，濃縮至 100ml量瓶中。(2)加水倍量考察:分別稱取生地黃飲片50g，煎煮時間為90min，煎煮2 次，加水倍量分別為8、10、12、14、16 倍，過濾，并將所得濾液濃縮至100ml量瓶中。(3)提取次數(shù)考察:分別稱取生地黃飲片50g，煎煮時間為90min，加水量10倍，煎煮次數(shù)分別為1、2、3、4次，過濾，并將所得濾液濃縮至100ml量瓶中。

4．中心組合設(shè)計優(yōu)選水提工藝條件:在煎煮時間、加水倍量、煎煮次數(shù)3個影響生地黃多糖和梓醇含量的單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法將這3個影響因素作為自變量，將生地黃多糖及梓醇綜合加權(quán)含量進(jìn)作為響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行設(shè)計。綜合評分=0．4W1/Wmax1+0．6W2/Wmax2，W1為多糖含量，Wmax1為多糖含量最大值，W2為梓醇含量，Wmax2為梓醇含量最大值。

5．統(tǒng)計學(xué)方法:采用Design Expert統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料用方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．多糖含量測定線性范圍:(1)檢測波長的確定:取對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)系列中含量為0．0486mg的葡萄糖對照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白對照，以200～800nm波長掃描，測定葡萄糖的最大吸收。結(jié)果葡萄糖在625nm波長處有最大吸收值。(2)線性關(guān)系考察:分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0．3、0．6、0．9、1．2、1．5、1．8ml置具塞試管中，加水至 2．0ml，加入新鮮配制的0．2%蒽酮試劑4ml，沸水浴15min，取出立即置冰水浴冷卻20min，以相應(yīng)試劑為空白，在625nm測定吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以測得的吸光度為縱坐標(biāo)，計算回歸方程為:Y=5．0988X+0．1334(R2=0．9995)。結(jié)果表明，在0．0162 ～0．0972mg的范圍內(nèi)線性良好。

2．梓醇含量測定線性范圍:精密吸取梓醇對照品溶液 3、6、9、12、15、18μl，依“梓醇的含量測定”項下色譜條件進(jìn)行測定，以梓醇的含量為橫坐標(biāo)，以測得的峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程為:Y=150045X+35910(R2=0．9997)，結(jié)果表明，在 0．462 ～2.772μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3．單因素實(shí)驗(yàn):(1)提取時間的考察:按照本文中“多糖的含量測定”項下方法及“梓醇的含量測定”項下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測定多糖及梓醇的含量。進(jìn)行綜合評分(即多糖含量權(quán)重系數(shù)為0．4，梓醇含量權(quán)重系數(shù)為0．6)。結(jié)果表明:加10倍量水，煎煮2次，每次煎煮90min時多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表1。(2)加水倍量考察:按照本文中“多糖的含量測定”項下方法及“梓醇的含量測定”項下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測定多糖及梓醇的含量。結(jié)果表明，煎煮2次，每次煎煮90min時，加10倍量水，多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表2。(3)提取次數(shù)考察:按照本文中“多糖的含量測定”項下方法及“梓醇的含量測定”項下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測定多糖及梓醇的含量。結(jié)果表明:加10倍量水煎煮90min，煎煮2次時多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表3。

表1 提取時間考察結(jié)果

表2 加水倍量考察結(jié)果

表3 提取次數(shù)考察結(jié)果

4．中心組合設(shè)計優(yōu)選水提工藝條件:(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計的因素與水平表見表4，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及中心組合設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。采用Design Expert軟件對所得的提取回歸模型方差分析結(jié)果見表6?；貧w方程中各個變量因素對加權(quán)含量響應(yīng)值的顯著性用F值來檢驗(yàn)，F(xiàn)的值越小，相應(yīng)的變量顯著程度越高。從表7中可以看出，方程中X2(加水倍量)、X3(煎煮次數(shù))、X1X2、(煎煮時間和加水倍量交互)(煎煮時間的二次方)、(加水倍量的二次方)、(煎煮次數(shù)的二次方)影響都比較顯著，X1、(煎煮時間)X1X3、(煎煮時間和煎煮次數(shù)交互)X2X3(加水倍量和煎煮次數(shù)交互)沒有顯著性影響。在3個因素中，煎煮次數(shù)和加水倍量對生地黃多糖和梓醇的加權(quán)含量影響比煎煮時間對其的影響要大。此模型的P＜0．0001，說明回歸模型達(dá)到高度顯著水平。失擬誤差P=0.585，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該模型對試驗(yàn)擬合情況較好，試驗(yàn)存在誤差較小，可以用此模型對水煎煮生地黃多糖及梓醇含量進(jìn)行分析和預(yù)測。由Box－Behnken試驗(yàn)擬合出的多糖及梓醇加權(quán)含量Y對提取時間X1、加水倍量X2、提取次數(shù)X3的二次多項回歸方程為:Y=0．91 －1．521E －003X1+8．649E －003X2+0．017X3+0．010X1X2+4．247E －003X2X3+(2)響應(yīng)面優(yōu)化與分析:根據(jù)二次多項式方程，分別繪制指標(biāo)與響應(yīng)顯著的交互項的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，比較圖1～圖3中響應(yīng)曲面圖可知，煎煮時間和加水倍量的交互作用對生地黃多糖及梓醇含量的提取率為最顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面，故煎煮時間和加水倍量的調(diào)整對生地黃多糖及梓醇含量的影響較大。煎煮次數(shù)與其他兩因素的交互作用不及煎煮時間和加水倍量的交互作用明顯。由Design Expert軟件給出了最佳條件為:提取時間為117．53min，加水倍量為13．75倍，提取次數(shù)為2次，預(yù)測的最佳提取率加權(quán)評分為0．81。但是根據(jù)實(shí)際情況及可操作性，調(diào)整的最佳提取工藝條件為提取時間120min，加水倍量14倍，提取次數(shù)2次。

表4 因素與水平

表5 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表6 回歸方程方差分析

圖1 煎煮時間和加水倍量對加權(quán)含量的影響

5．驗(yàn)證試驗(yàn):按修正過的最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，3 個平行實(shí)驗(yàn)的綜合評分分別為0．79、0．80、0.82，平均值為0．80。與預(yù)測值基本一致，可見響應(yīng)模型可以較好的反映出生地黃多糖及梓醇的提取的條件。

討 論

本實(shí)驗(yàn)以生地黃中主要成分梓醇及多糖含量的綜合評分作為評價指標(biāo)，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計－響應(yīng)面法優(yōu)選最佳水提取工藝研究。確定了最優(yōu)的水提取條件為:加14倍倍量水，提取2次，每次120min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

圖2 加水倍量和煎煮次數(shù)對加權(quán)含量的影響

圖3 煎煮時間和煎煮次數(shù)對加權(quán)含量的影響

生地黃中主要含有多糖和環(huán)烯醚萜苷類成分，提取工藝的評價指標(biāo)也多為多糖和梓醇的含量。多糖及環(huán)烯醚萜苷類都為極性比較大的成分，且水溶性較強(qiáng)，根據(jù)相似相溶原理及相關(guān)些文獻(xiàn)報道，最終選擇水作為提取溶媒，以多糖及環(huán)烯醚萜苷中主要成分梓醇的含量作為綜合評價指標(biāo)。考慮到多次提取會提高多糖提取率，但因環(huán)烯醚萜苷類對熱不穩(wěn)定，不能長時間煎煮，實(shí)驗(yàn)設(shè)計中考慮到這些因素，對生地黃的提取時間、提取次數(shù)、溶媒用量進(jìn)行設(shè)計，優(yōu)選合理的提取條件。

對環(huán)烯醚萜苷類化合物含量測定的報道較少，文獻(xiàn)報道的方法有對二甲氨基苯甲醛顯色－分光光度法、二階導(dǎo)數(shù)分光光度法，紫外分光光度法［3～6］。本實(shí)驗(yàn)曾采用二甲氨基苯甲醛顯色－分光光度法，以梓醇為對照品，經(jīng)酸水解，二硝基苯肼乙醇試液和NaOH 70%乙醇溶液顯色后在463nm處測定其含量［7］。本研究結(jié)果顯示，此方法顯色復(fù)雜，所得數(shù)據(jù)差異較大，穩(wěn)定性及重復(fù)性差，說明此反應(yīng)不穩(wěn)定，其中影響因素過多，不易操作，且測定的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)際含量。文獻(xiàn)報道中提出可對地黃中的總環(huán)烯醚萜類成分——梓醇進(jìn)行測定，其在210nm附近有最大吸收，從而對其水溶液直接采用紫外測定。但在實(shí)驗(yàn)中，因很多物質(zhì)在210nm都有吸收，加上藥液本身的顏色，種種因素都會對結(jié)果有較大的影響，最后導(dǎo)致了我們在實(shí)驗(yàn)中測定的含量遠(yuǎn)高于實(shí)際含量，所以這個方法對于測定環(huán)烯醚萜的含量也不是很合適。因此，最終決定采用環(huán)烯醚萜苷中的主要成分梓醇作為評價總環(huán)烯醚萜苷含量的指標(biāo)。

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