不同培養(yǎng)條件對(duì)拮抗酵母菌0732-1產(chǎn)生抑細(xì)菌物質(zhì)的影響

王曉東，陳好娟，王春娟，葛米紅

（1石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子 832003；2武漢市農(nóng)科所,武漢 430065）

隨著近幾年來對(duì)生防酵母菌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)生防酵母菌除了具有營養(yǎng)競爭的能力外，某些酵母菌還能夠產(chǎn)生一些抑真菌物質(zhì)(Antifungal substances，AFS)[1-4]，這些AFS包括一些揮發(fā)性和不揮發(fā)性成份[5-8]。在生防作用過程中，AFS起到了很重要的角色，它不僅進(jìn)一步擴(kuò)大和增強(qiáng)了拮抗酵母菌在環(huán)境中的與敏感菌株的競爭能力[9]，而且增強(qiáng)了其生防效果。因此，目前對(duì)具有多種拮抗作用類型的微生物倍受人們的關(guān)注，已成為生防菌研究的熱點(diǎn)。

我們在拮抗酵母菌平板篩選和帶菌種子處理的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)酵母菌0732-1發(fā)酵液中含有某類對(duì)Aac具有抗生作用的物質(zhì)，并將這種物質(zhì)稱之為抗細(xì)菌物質(zhì)（Antibacterial substances，ABS）。 雖然關(guān)于Pichia anomala產(chǎn)生AFS的報(bào)道很多[9-11]，但是對(duì)P.anomala產(chǎn)生ABS的研究未見有報(bào)道。眾所周知，微生物生存的環(huán)境不同其代謝方式也會(huì)存在很大差異，產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)在質(zhì)和量上或多或少也可能發(fā)生變化[10-11]。營養(yǎng)物質(zhì)的選擇和培養(yǎng)條件的適宜，均對(duì)拮抗微生物產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的合成、產(chǎn)量和質(zhì)量造成很大影響。提供良好的培養(yǎng)基配比和培養(yǎng)條件可以充分發(fā)揮生產(chǎn)菌種的生物合成能力，使之達(dá)到最大的生產(chǎn)效果。針對(duì)此，本研究初步探討和分析了酵母菌0732-1在培養(yǎng)條件下對(duì)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響，旨在為更好地發(fā)揮好其生防效果，以及提取、純化ABS和研究其特性奠定可靠基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基

PSB、KB、PDB、LB 培養(yǎng)液和 KBA 培養(yǎng)基參照植病研究法[12]制備。碳源、氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備方法參照文獻(xiàn)[1 3]進(jìn)行。YEPB培養(yǎng)液參照文獻(xiàn)[14]中的方法制備。NYPB培養(yǎng)液：牛肉膏1.0 g，大豆蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，酵母粉 7.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.7。YPDB培養(yǎng)液：1%酵母汁，5%甘油，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g。用蒸餾水1.0 mL配制。以上培養(yǎng)（基）液121℃滅菌25 min后備用。

1.1.2 供試菌株及培養(yǎng)

酵母菌0732-1為自主篩選所得。Aac由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植病教研室提供?；罨蟮慕湍妇?732-1和Aac分別接種在PDB和KB培養(yǎng)液中，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后，備用。

1.2 方法

1.2.1 抗細(xì)菌生物活性測定

采用瓊脂孔擴(kuò)散法。將培養(yǎng)好的Aac培養(yǎng)物用無菌水配制成 1×108cfu/mL 菌懸液（OD600≈0.3），吸取1 mL菌懸液注入KBA培養(yǎng)基平板中央，晃動(dòng)平板使菌液布滿全皿，傾斜平板，吸出多余菌液，在無菌條件下，吹干培養(yǎng)基表面的水分。然后用直徑為7 mm無菌打孔器打孔，吸取100 μL酵母菌0732-1發(fā)酵物上清液（已滅菌）注入瓊脂孔中，置28℃下培養(yǎng)48 h后，觀察并測定抑菌圈的直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基對(duì)ABS產(chǎn)生的影響

1.2.2.1 碳源對(duì)ABS產(chǎn)生的影響

稱取蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、檸檬酸鈉、可溶性淀粉、甘油、果糖各4.0 g，量取5.0 mL無水乙醇，分別加入到200 mL碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻后，每種碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液分裝至4個(gè)150 mL三角瓶中，每瓶50 mL。121℃滅菌25 min后，3瓶培養(yǎng)液接種0.5 mL 1×108cfu/mL酵母菌懸浮液，以不接種的1瓶為對(duì)照。將各碳源培養(yǎng)液的三角瓶置于28℃ 160 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h后，取30 mL的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，4℃，8000 r/min離心15 min，收集上清液，滅菌后測定其抗Aac活性。

1.2.2.2 氮源對(duì)ABS產(chǎn)生的影響

測定的氮源包括硫酸銨、磷酸氫二鉀、尿素、蛋白胨、硝酸鉀和硝酸銨。分別稱取4 g添加至200 mL氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。滅菌后分裝至4個(gè)三角瓶中（150 mL）。以氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照（CK）。接種酵母菌0732-1培養(yǎng)、培養(yǎng)液處理、培養(yǎng)液抗細(xì)菌活性測定等操作方法參見上述碳源試驗(yàn)（1.2.2.1）。

1.2.3 培養(yǎng)液類型ABS產(chǎn)生的影響

將制備好的 PDB、PSB、YEPD、KB、NYPB、LB 和YPDB培養(yǎng)液分別分裝于4個(gè)三角瓶中，每瓶裝50 mL。 滅菌后（121 ℃，25 min），調(diào)節(jié) pH 6.0，吸取0.5 mL 1×108cfu/mL酵母菌懸液接種于每種培養(yǎng)液的3個(gè)三角瓶中，以不接種的1瓶培養(yǎng)液為對(duì)照。將各三角瓶28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，取30 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。4℃，8000 r/min離心15 min，收集上清液，滅菌后測定抗Aac活性。

根據(jù)6上105-2工作面支架工作阻力實(shí)測，r=12 834 kN，p0=5 563 kN，Δhi=600 mm，ΔhA=1 394 mm，計(jì)算得K=3 130 kN。

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)ABS產(chǎn)生的影響

1.2.4.1 培養(yǎng)基初始pH值的影響

在無菌環(huán)境中，用 0.1 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH 將 PSB 培養(yǎng)液分別調(diào)節(jié)至 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和 11.0 共 11 個(gè) pH 值梯度。將每個(gè)pH梯度PSB培養(yǎng)液分裝至4個(gè)滅菌的150 mL三角瓶中，每瓶50 mL。其中3瓶接種0.5 mL 1×108cfu/mL酵母菌0732-1菌懸液，1瓶不接種留作對(duì)照。各三角瓶在26℃、160 r/min條件下?lián)u培48 h后，測定各三角瓶中培養(yǎng)物的pH值。然后取出30 mL酵母菌培養(yǎng)物及對(duì)照置于50 mL離心管中，4℃，8000 r/min離心15 min，收集上清液，滅菌后測定其抗Aac的活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.2 培養(yǎng)液裝樣量的影響

將PSB培養(yǎng)液按20、25、30、40、60、80、100、125、165和210 mL分別裝入250 mL的三角瓶中，121℃下滅菌25 min后，以三角瓶中培養(yǎng)液體積的1%接種量接種1×108cfu/mL酵母菌0732-1菌懸液，密封三角瓶瓶口后，在28℃、160 r/min條件下?lián)u培60 h。取出培養(yǎng)物測定其pH值后，倒出30 mL各酵母菌培養(yǎng)物及對(duì)照于50 mL離心管中，4℃，8000 r/min離心15 min，分別收集3次重復(fù)的培養(yǎng)物上清液，滅菌，按同上（1.2.1）中方法測定上清液抗Aac的生物活性。以PSB培養(yǎng)液為對(duì)照。

1.2.4.3 發(fā)酵溫度的影響

取 0.5 mL 1×l08cfu/mL 酵母菌 0732-1 菌懸液，接種至50 mL PSB培養(yǎng)液中，分別置于20、25、28、30、37和 40℃恒溫?fù)u床上搖培 60 h （160 r/min）。 按上述方法（1.2.1）測定各發(fā)酵液的 pH 值、上清液抑制Aac的活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)ABS的影響

1.2.4.5 接種量的影響

將新鮮的1×l08cfu/mL酵母菌0732-1菌懸液，按照接種量 0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、5.0%和10.0%（V/V）分別接種到含有60 mL PSB培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，在28℃、160 r/min下?lián)u培60 h后，測定各三角瓶中酵母菌培養(yǎng)物的pH值。取30 mL各培養(yǎng)物至50 mL離心管中，4℃，8000 r/min離心 15 min，收集上清液。按 1.2.1 中的方法測定上清液對(duì)Aac的抗菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用SAS 8.0中的方差分析程序 （ANOVA）分析上述各試驗(yàn)中不同處理間的差異顯著性。采用Duncan氏新復(fù)極差法比較處理之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響

圖1可見：酵母菌0732-1能利用果糖、葡萄糖、麥芽糖和乙醇產(chǎn)生ABS，且發(fā)酵物離心后上清液的抑菌圈直徑為 0.5～9.8 mm。利用果糖產(chǎn)生 ABS抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為9.8 mm。其次為葡萄糖。以甘油為碳源時(shí)，酵母菌發(fā)酵液上清中抑菌活性最弱，抑菌圈直徑為0.1 mm。以淀粉、蔗糖和檸檬酸鈉為碳源時(shí)，發(fā)酵液未能產(chǎn)生抑菌圈。因此，發(fā)酵液pH與抑菌圈大小無相關(guān)性。

圖1 碳源對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.1 The influence of carbon sources on ABS substances produced by the yeast strain 0732-1

2.2 氮源對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響

由圖2可見：葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)液中，酵母菌0732-1利用硫酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫銨和蛋白胨能產(chǎn)抑菌圈，以硫酸銨為最適，發(fā)酵液的抑菌圈直徑14.6 mm，硝酸鉀抑菌圈直徑為1.2 mm。尿素和硝酸銨不利于酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS。

圖2 氮源對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.2 The influence of nitrogen sources on ABS produced by the yeast strain 0732-1

2.3 培養(yǎng)液對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響

由圖3可見：7種培養(yǎng)液培養(yǎng)酵母菌0732-1后，6種發(fā)酵液上清均能產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其中PSB和EYPB抑菌效果顯著，抑菌圈直徑均為11.0 mm；KB、YPDB和PDB發(fā)酵液上清抑菌活性間差異不顯著， 形成抑菌圈直徑分別為 5.0、4.7 和 5.7 mm，NYPB發(fā)酵液未產(chǎn)生抑菌圈。說明PSB或EYPB利于0732-1產(chǎn)生ABS。

圖3 不同培養(yǎng)液對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.3 The influence of different liquid media on ABS produced by the yeast strain 0732-1

2.4 初始pH的影響

由圖4可見：原培養(yǎng)液pH值＞5.0時(shí)，酵母菌0732-1發(fā)酵液上清抑細(xì)菌活性增強(qiáng)，抑菌圈直徑為9.1～10.3 mm， 培養(yǎng)后 pH 為 3.6～4.1。 當(dāng)原培養(yǎng)液pH值為9.0時(shí)，酵母菌0732-1培養(yǎng)后，發(fā)酵液上清抑菌活性最強(qiáng)，發(fā)酵液pH為3.9，抑菌圈直徑達(dá)11.7 mm。

圖4 初始pH值對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.4 The influence of the initial pH on ABS produced by the yeast strain 0732-1

2.5 培養(yǎng)液裝樣量的影響

由圖5可見：當(dāng)裝樣量為20～40 mL時(shí)，發(fā)酵液pH 較高，為 7.2～7.4，發(fā)酵液上清液對(duì) Aac 不具有抑菌活性。當(dāng)裝樣量為60～200 mL時(shí)，酵母菌0732-1培養(yǎng)后pH出現(xiàn)先降后升的趨勢；發(fā)酵液上清pH的變化由4.5降至3.7。當(dāng)裝樣量為80 mL時(shí)，培養(yǎng)后發(fā)酵液上清pH為3.7，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為 12.1 mm。

圖5 培養(yǎng)液裝液量對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.5 The influence of medium volume on ABS produced by the yeast strain 0732-1

2.6 溫度的影響

由圖6可見：在溫度為20～40℃時(shí)，酵母菌0732-1均可生長且對(duì)抑細(xì)菌活性有不同程度的影響。當(dāng)溫度為20℃時(shí)，發(fā)酵液上清pH最低，為3.42，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為11.1 mm。在25～35℃時(shí)，酵母菌0732-1發(fā)酵液上清pH隨著溫度的升高而呈上升趨勢，但抑菌活性不斷下降。由此說明，酵母菌0732-1產(chǎn)生的ABS可能是一種酸性物質(zhì)。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.6 The influence of incubation temperature on ABS produced by the yeast strain 0732-1

2.7 培養(yǎng)時(shí)間的影響

由圖7可見：發(fā)酵液pH值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長出現(xiàn)先降低，后升高的趨勢，但發(fā)酵液上清的抑菌圈直徑卻出現(xiàn)先升高，后降低的趨勢。培養(yǎng)96 h時(shí)，發(fā)酵液上清pH值最低，為3.24，但其抑菌圈最大，直徑為26.4 mm。由此可以說明：發(fā)酵液中抑菌物的抑菌活性與其pH值高低成正相關(guān)，酸性時(shí)具有抑菌活性，當(dāng)發(fā)酵液的pH＞4.5時(shí)，基本無抑菌圈產(chǎn)生。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.7 The influence of incubation time on ABS prduced by the yeast strain 0732-1

2.8 接種量的影響

由圖8可見：酵母菌0732-1抑菌活性隨接種量的增大而增強(qiáng)，發(fā)酵液pH的變化基本隨接種的增大而呈降低趨勢。接種量為0.2%時(shí)，發(fā)酵液pH為 4.3，抑菌圈最小，直徑為 5.9 mm，在接種量為10%時(shí)，發(fā)酵液pH為3.5，其抑菌圈直徑最大，達(dá)14.0 mm。

圖8 接種量（V/V）對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS的影響Fig.8 The influence of the inoculation concentration on ABS produced by the yeast strain 0732-1

3 結(jié)論與討論

通過不同培養(yǎng)條件下對(duì)酵母菌0732-1產(chǎn)ABS的影響，結(jié)果表明各單因子的梯度范圍內(nèi)，產(chǎn)生ABS最適碳源為果糖；以葡萄糖為碳源，最適氮源為硫酸銨。以PSB為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，初始pH為9.0；裝樣量為80 mL（250 mL三角瓶）；以10%的接種量；培養(yǎng)溫度為20℃；培養(yǎng)96 h利于酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS，且抑菌活性最強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)上述各單因子培養(yǎng)條件下發(fā)酵液的pH值越低其抑菌活性越強(qiáng)。由此說明產(chǎn)生的ABS可能是一種酸性物質(zhì)，且或ABS抑菌活性可能與其營造的酸性環(huán)境有直接的關(guān)系。這可能與酵母菌利用營養(yǎng)物質(zhì)代謝的方式有關(guān)。對(duì)于具體的產(chǎn)ABS發(fā)酵體系及代謝途徑還有待于進(jìn)一步探討。

在酵母菌發(fā)酵過程中，代謝環(huán)境條件的調(diào)控是所獲目的代謝物必要的手段。酵母菌群體歷經(jīng)了繁殖、生長和衰老的生命過程，在此過程中發(fā)生著各種生物化學(xué)變化，是生物體與其生存環(huán)境不斷地進(jìn)行物質(zhì)、能量、熱量傳遞和交換的動(dòng)態(tài)過程[15]。影響酵母菌生存環(huán)境的因素主要有溫度、pH值、底物濃度、溶解氧等[16]。本試驗(yàn)中通過人為控制培養(yǎng)條件對(duì)酵母菌0732-1代謝物中酸性ABS的產(chǎn)出的研究結(jié)果分析，推測這種酸性的ABS可能與酵母菌糖代謝中的糖酵解途徑中的酒精發(fā)酵有密切關(guān)系，同時(shí)認(rèn)為培養(yǎng)條件中溶氧是產(chǎn)生ABS關(guān)鍵的調(diào)控因子。酵母在厭氧性環(huán)境中，糖的利用是通過糖酵解EMP途徑完成的，形成乳酸或乙醇等發(fā)酵物；好氧性的利用則是由EMP途徑產(chǎn)生的丙酮酸經(jīng)三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle）通過呼吸鏈徹底分解氧化，形成CO2、H2O和ATP。上述2條途徑是酵母菌糖代謝的主要方式[17]。厭氧性發(fā)酵途徑是酵母菌糖酵解中的酒精發(fā)酵時(shí)形成的有機(jī)酸的主要途徑，代謝的有機(jī)酸包括酮酸、羥基、二羧酸、三羧酸、脂肪酸等。我們通過本試驗(yàn)結(jié)果初步推斷，當(dāng)培養(yǎng)液接種的初期，酵母菌體濃度較低，氧與碳源較充足情況下，酵母菌都能夠得到最大限度的生長，此時(shí)糖以丙酮酸高流量轉(zhuǎn)化，在有氧條件下，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，丙酮酸被徹底氧化，培養(yǎng)液中有氣泡產(chǎn)生，釋放出CO2。當(dāng)三角瓶中的氧缺少或供應(yīng)不足，那么代謝將進(jìn)入酒精發(fā)酵階段，從而形成大量的有機(jī)酸副產(chǎn)物，發(fā)酵液pH再度下降，酸性ABS在發(fā)酵液中存量較多，抑菌活性較強(qiáng)。因此可得出，氧對(duì)酵母菌的代謝途徑的影響至關(guān)重要[18]。酵母菌0732-1產(chǎn)生ABS發(fā)酵體系一個(gè)復(fù)雜多因子協(xié)調(diào)的體系，對(duì)發(fā)酵機(jī)理以及代謝調(diào)節(jié)控制還有待進(jìn)一步深入研究。此方面的研究將為高效獲得且符合要求所需的代謝物提供重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

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