叉毛蓬體外抗氧化活性的研究

孫文，王瑩，孫葉帥，朱林，馬瑤，楊紅兵

（石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，石河子 832003）

自由基是有機(jī)化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的含有一個(gè)不成對(duì)電子的原子團(tuán)，主要包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、烷基自由基、脂質(zhì)過氧化自由基等[1]。自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和某些疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病的重要因素[2-3]。目前在醫(yī)療和食品領(lǐng)域中，使用較多的是合成抗氧化劑（如BHA，BHT，TBHQ等）來消除人體內(nèi)的自由基[4]，近年來人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)人工合成的抗氧化劑皆有一定的毒性[5]，而傳統(tǒng)中草藥和天然植物中含有許多自由基清除劑（如黃酮類、酚類、生物堿類等），均有較強(qiáng)的抗氧化作用，且安全、健康、無毒[6]。因此，從植物中尋找和開發(fā)能夠清除自由基的天然抗氧化劑已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

叉毛蓬（Petrosimonia sibirica L.）為藜科（Chenopodiaceae）叉毛蓬屬（Petrosimonia Bunge）一年生草本植物，大多生長(zhǎng)在干旱、鹽堿地區(qū)，主要分布于新疆，是新疆的特色植物。叉毛蓬粗蛋白含量與禾草相近，具有一定的飼用價(jià)值，是荒漠草場(chǎng)中良好的牧草之一[7-9]。

藜科植物在我國(guó)分布廣泛，所含化學(xué)成分種類豐富，其生物活性的研究也越來越受到重視[10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)叉毛蓬的研究主要集中在遺傳學(xué)[11]和生態(tài)學(xué)[12]方面，有關(guān)其化學(xué)成分和活性研究的報(bào)道較少。據(jù)本課題組前期研究工作得知，叉毛蓬提取物具有良好的抗菌活性[13]。本文以叉毛蓬為研究對(duì)象，利用3三種不用的抗氧化性方法研究其抗氧化活性，以期為進(jìn)一步追蹤分離叉毛蓬中的活性成分提供參考，也為新疆藜科植物的合理開發(fā)和利用積累科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑、儀器

1.1 材料與試劑

叉毛蓬全株于2011年9月采自新疆瑪納斯，由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院閆平教授鑒定。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH），Tert-Butylhydroquinone （TBHQ） 購(gòu)自 Sigma公司；2,4,6-Tris （2-pyridyl）-s-triazine（TPTZ），購(gòu)自阿拉丁公司；抗壞血酸（AA），F(xiàn)eCl3·6H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，焦性沒食子酸，乙酸鈉，冰醋酸，甲醇等均為分析純。

1.2 儀器

Rotavapor R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，B-490型電熱恒溫水浴鍋，GZX-9030 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，SHZDⅢ型循環(huán)水真空泵，電子天平，紫外可見分光光度計(jì)，KDM型調(diào)溫電熱套。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 叉毛蓬提取物的制備

2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定[14]

配置0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液待用。在試管中分別加入2 mL不同濃度的待測(cè)液和2 mL的DPPH甲醇溶液，搖勻，避光靜置30 min，然后在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度?？箟难幔ˋA）和叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）作陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率，

上式中：An為2 mL待測(cè)液與2 mL DPPH甲醇溶液混合后的吸光度值；Am為2 mL甲醇與2 mL DPPH甲醇溶液混合后的吸光度值。

2.3 O2-·自由基清除率的測(cè)定[15]

2.3.1 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定

量取 5 mL，pH 8.2的 50 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液和2 mL雙蒸水，混勻后放于25℃水浴中恒溫20 min，然后立即加入在25℃下預(yù)熱過的3 mmol/L的鄰苯三酚0.5 mL（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚鹽酸溶液)，迅速搖勻后在325 nm處每隔30 s，測(cè)其吸光度。

2.3.2 樣品活性的測(cè)定

按2.3.1中步驟進(jìn)行測(cè)定，加鄰苯三酚前加入0.2 mL不同濃度的待測(cè)液，雙蒸水的量隨之減少。抗壞血酸（AA）作陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算O2-·自由基清除率。

式（2）中：A0為鄰苯三酚自氧化吸光度值；A1為加入樣品溶液后鄰苯三酚自氧化吸光度值。

2.4 鐵離子還原能力的測(cè)定-FRAP法[16]

2.4.1 FRAP工作液的配置

凱安跟我說，學(xué)校的所有孩子都很羨慕他。上次，他跟同學(xué)說下課以后要趕緊回家把作業(yè)做完，這樣就能跟哥哥玩彈珠，同學(xué)們都對(duì)他說：“你好幸運(yùn)哦！我們回家要是寫完作業(yè)，爸爸媽媽會(huì)很高興。因?yàn)樗麄兡軌蚪o我們布置更多的家庭作業(yè)，把我們累死了。所以，我們回家以后盡量拖拖拉拉寫作業(yè)，為了避免做更多的作業(yè)?！?/p>

0.3 mol/L pH 3.6 的醋酸鹽緩沖液（a）；10 mmol/L TPTZ溶液用 40 mmol/L的 HCl配置（b）；20 mmol/L FeCl3溶液（c）。FRAP 工作液由 a∶b∶c=10∶1∶1 配置而成。

2.4.2 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，然后各加入3.0 mL的FRAP工作液和0.3 mL蒸餾水，充分混勻后，37℃反應(yīng)30 min，于593 nm處測(cè)其吸光度。根據(jù)FeSO4的濃度與吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=0.702x+0.084，R2=0.9942。

2.4.3 樣品活性的測(cè)定

按2.4.2中步驟進(jìn)行測(cè)定。待測(cè)液的還原能力用FeSO4的當(dāng)量（mmol/g）表示，即 1 g提取物的還原能力與多少mmol FeSO4的還原能力相當(dāng)?？箟难幔ˋA）和叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）作陽(yáng)性對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其清除實(shí)驗(yàn)是體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法中常用的一種[17]。樣品的DPPH自由基清除能力一般以半數(shù)抑制率IC50值表示，IC50值越小表明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[18]。

叉毛蓬提取物清除DPPH自由基的效果如圖1所示。圖1顯示：DPPH自由基的清除率均隨著提取物濃度的增加而增大，并且在一定濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，自由基清除率由大到小的排列順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛∥铹兟确绿崛∥铹冋〈继崛∥铹兪兔烟崛∥铹円掖即痔?，且它們的值分別為 96.68%、91.24%、90.41%、89.04%和79.25%。

由表1可知，叉毛蓬乙酸乙酯提取物及氯仿提取物的抗氧化能力較好，IC50值分別為69.69 μg/mL，78.91 μg/mL，但均低于陽(yáng)性對(duì)照 AA（IC50=3.61 μg/mL）和 TBHQ（IC50=3.41 μg/mL）。

圖1 叉毛蓬不同提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

3.2 O2-自由基清除率的測(cè)定

O2-自由基是一種活性氧，是機(jī)體內(nèi)壽命最長(zhǎng)的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基，進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成傷害[19]。因此，對(duì)O2-·自由基的清除能力進(jìn)行測(cè)定具有非常重要的意義。

由圖2可知，石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在整個(gè)濃度測(cè)定范圍內(nèi)都呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系，O2-·自由基清除率的變化范圍分別為 2.28%～32.07%、13.97%～73.43%、16.83%～84.88%以及26.74%～51.14%。

由表1可知：叉毛蓬乙酸乙酯提取物的抗氧化能力最好 （IC50=6.57 mg/mL），其次是氯仿提取物（IC50=7.59 mg/mL），但均弱于陽(yáng)性對(duì)照AA （IC50=0.44 mg/mL）。

圖2 叉毛蓬不同提取物清除O2-·自由基的能力Fig.2 O2-free radical scavenging activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

3.3 鐵離子還原能力的測(cè)定-FRAP法

鐵離子還原法是對(duì)總的抗氧化能力進(jìn)行的評(píng)價(jià)，它是基于黃色的Fe3+-TPTZ絡(luò)合物可被還原性物質(zhì)還原為藍(lán)色Fe2+-TPTZ絡(luò)合物這一反應(yīng)過程中顏色的變化。Fe2+-TPTZ在593 nm處有特征吸收，吸光度值越大，表明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，則抗氧化性也越強(qiáng)[20]。

由表1可知，叉毛蓬不同溶劑提取物間的還原能力相差不大，提取物及陽(yáng)性對(duì)照的抗氧化能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋篢BHQ﹥AA﹥氯仿提取物﹥乙酸乙酯提取物﹥正丁醇提取物﹥乙醇粗提物﹥石油醚提取物。

表1 叉毛蓬不同提取物的抗氧化活性Tab.1 Antioxidant activity of the different extracts of Petrosimonia sibirica

4 結(jié)論

1）在采用DPPH和鄰苯三酚自氧化2種方法中，叉毛蓬提取物的抗氧化活性順序一致，具體表現(xiàn)為：乙酸乙酯提取物﹥氯仿提取物﹥正丁醇提取物﹥石油醚提取物﹥乙醇粗提物。

2）采用FRAP法，抗氧化活性順序?yàn)椋郝确绿崛∥铹円宜嵋阴ヌ崛∥铹冋〈继崛∥铹円掖即痔嵛铹兪兔烟崛∥铩?/p>

3）氯仿提取物和乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最好，通常情況下氯仿或乙酸乙酯溶劑主要萃取游離生物堿、黃酮、有機(jī)酸等中等極性化合物，這表明叉毛蓬可能含有豐富的生物堿、黃酮等活性成分。

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