基質金屬蛋白酶和細胞因子在多關節(jié)型JIA中的臨床意義

劉小惠

（江西省兒童醫(yī)院風濕免疫科，南昌 330006）

基質金屬蛋白酶和細胞因子在多關節(jié)型JIA中的臨床意義

劉小惠

（江西省兒童醫(yī)院風濕免疫科，南昌 330006）

目的探討多關節(jié)型幼年特發(fā)性關節(jié)炎（JIA）患兒血清和關節(jié)液中基質金屬蛋白酶和細胞因子的表達差異及其臨床意義。方法ELISA法檢測58例患兒成對血清和關節(jié)液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1，IL-1、IL-6和 TNF-α的表達水平，并分析其相關性?；仡櫡治霾v記錄并建立臨床和實驗室疾病活動性適應證判定標準，探討這些因子的水平和疾病活動性指標之間的關系。結果JIA組血清和關節(jié)液中 MMP-1、MMP-3、IL-1、IL-6、TNF-α濃度明顯高于對照組（P＜0.01），TIMP-1濃度低于對照組（P＜0.05），關節(jié)液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、IL-1、IL-6、TNF-α濃度明顯高于血清濃度（P＜0.01）。JIA 組關節(jié)液中IL-1與MMP-1呈正相關，而IL-1與TIMP-1之間呈負相關。結論JIA的部分作用機制可能是通過刺激基質金屬蛋白酶和細胞因子表達實現(xiàn)。

基質金屬蛋白酶類；細胞因子；白細胞介素；幼年特發(fā)性關節(jié)炎；多關節(jié)

國際風濕病聯(lián)盟于2001年將發(fā)生于16歲以下青少年的不明原因關節(jié)腫脹并持續(xù)6周以上的關節(jié)炎統(tǒng)一命名為幼年特發(fā)性關節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA），取代了以往的幼年類風濕關節(jié)炎和幼年慢性關節(jié)炎分類標準［1－3］。JIA是一組原因未明的慢性自身免疫性疾病，病程持久，常累及多個器官，可導致兒童殘疾和失明［4］。JIA通常有全身型、少關節(jié)型和多關節(jié)型等多種亞型，其中的多關節(jié)型具有致殘率高和預后差等特點［5－6］。根據(jù)血液中是否存在自身抗體－類風濕因子（RF），又可以將多關節(jié)型JIA分為兩型：RF陰性和RF陽性。JIA的發(fā)病機制尚不明確，一般認為是個體遺傳易感性、環(huán)境因素和免疫功能紊亂共同作用的結果。在JIA的發(fā)生、發(fā)展過程中，持續(xù)存在免疫炎癥反應，涉及多種免疫細胞和炎癥因子，如白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和基質金屬蛋白酶（MMP）等［7－9］，它們形成一個信號網(wǎng)絡，通過參與免疫細胞增殖活化和基質細胞分泌等生物學過程直接或間接影響疾病的進程。本研究選取了2013年3月至2014年3月本院收治的58例多關節(jié)型JIA患兒，檢測患兒血清和關節(jié)液中細胞因子和MMP的水平，分析它們之間的相關性，探討其在JIA疾病活動中的作用和臨床意義，為JIA的機制研究提供有益的參考，也為臨床上尋找新的藥物和治療方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年3月至2014年3月本院收治的58例多關節(jié)型JIA患兒，診斷分型符合ILAR Durban關于JIA的分類診斷標準。根據(jù)臨床體征、實驗室和輔助檢查，排除腫瘤、急性感染、全身型JIA和其他風濕性疾病。58例患兒中，男22例，女36例，年齡3.9～14.6歲，平均（5.3±1.1）歲；病程8～65個月，平均（16±7）個月；活動期至少有5個關節(jié)受累，同時伴有關節(jié)腫痛、局部發(fā)熱或關節(jié)活動受限等表現(xiàn)。對照組收集本院同期收治的外傷關節(jié)炎兒童志愿者的血清和關節(jié)液46例，年齡、性別與JIA組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)本院學術倫理委員會討論通過，患兒家長均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 疾病活動度分析 回顧分析患者病例記錄，建立臨床和實驗室疾病活動度指標。活動關節(jié)數(shù)（active joint count，AJC），紅細胞沉降率（erythrocyte sedimention rate，ESR），C反應蛋白（C reactive protein，CRP），血小板計數(shù)（platelet count，PLT），中性粒細胞計數(shù)（neutrophil count，NEC），白細胞計數(shù)（white cell count，WCC）。記錄了每一個采樣點的治療方法，包括非甾體類抗炎藥物治療和抗風濕藥物治療。

1.2.2 樣品采集 空腹抽取患兒外周靜脈血2～5mL于抗凝管中，離心后取上清液，－40℃保存待檢。同批檢測ESR、CRP、PLT、NEC、WCC等指標。采集關節(jié)腔積液時，先對患兒進行局部麻醉，然后采用膝關節(jié)髕上囊穿刺，抽取關節(jié)液于干燥管中，離心后取上清液，－40℃保存待檢。

1.2.3 ELISA法檢測 采用ELISA檢測血清和關節(jié)液中MMP-1、MMP-3、TIMP-1，IL-1、IL-6和 TNF－α的表達水平。商業(yè)化的試劑盒均購自Elabscience，線性范圍5～50ng／mL。MMP-1和 TIMP-1的捕獲抗體水平分別為2g／mL 和5g／mL，而 MMP-3的檢測限是12.5ng／mL。用于檢測 MMP的ELISA方法也可以識別 MMP前體和 MMP-TIMP-1復合物。所有樣品在同一時間點測定，具體操作步驟嚴格參照試劑盒的說明書進行。設定重復試驗，變異系數(shù)小于12%。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，進行t檢驗；計數(shù)資料進行χ2檢驗。檢驗水準α＝0.05。相關性分析采用Pearson回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 常規(guī)檢查結果 MMP-1與MMP-3與AJC有相關性，而與其他指標無顯著相關性；炎性因子IL-1、IL-6和 TNF－α與AJC、CRP、ESR、PLT、NEC、WCC之間都存在一定的相關性。見表1。

2.2 ELISA濃度測定 JIA組血清和關節(jié)液中 MMP-1、MMP-3、IL-1、IL-6、TNF-α濃度明顯高于對照組（P＜0.01），TIMP-1濃度低于對照組（P＜0.05），關節(jié)液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、IL-1、IL-6、TNF-α濃 度 明 顯 高 于 血 清 濃 度 （P＜0.01）。見表2、3。

2.3 JIA組關節(jié)液中IL-1與 MMP-1和 TIMP-1的相關性分析 IL-1與 MMP-1呈正相關，而IL-1與 TIMP-1之間呈負相關。見表4。

表1 MMP和細胞因子與常規(guī)檢查指標間相關性分析

2.4 MMP∶TIMP分析 如圖1所示，由相對分子質量為59×103的pro-MMP-3和52×103的pro-MMP-1及28×103的TIMP-1計算而來。關節(jié)液中的 MMP高于TIMP-1，而在血清中則相反。

圖1 MMP∶TIMP-1在JIA患者關節(jié)液與血清中的測定

表2 兩組關節(jié)液和血清中 MMP-1、MMP-3和TIMP-1的水平比較（ ±s）

表2 兩組關節(jié)液和血清中 MMP-1、MMP-3和TIMP-1的水平比較（ ±s）

項目 JIA組（n＝58） 對照組（n＝46）MMP-1（g／mL）關節(jié)液 0.46±0.19 0.15±0.06血清 0.07±0.01 0.04±0.01 MMP-3（g／mL）關節(jié)液 83.16±37.22 16.42±10.03血清 0.68±0.41 0.33±0.14 TIMP-1（g／mL）關節(jié)液 4.64±2.15 5.08±3.12血清0.78±0.36 0.84±0.29

表3 兩組關節(jié)液和血清中IL-1、IL-6和 TNF－α的水平比較（ ±s）

表3 兩組關節(jié)液和血清中IL-1、IL-6和 TNF－α的水平比較（ ±s）

項目 JIA組（n＝58） 對照組（n＝46）IL-1（ng／mL）關節(jié)液 0.060±0.020 0.009±0.004血清 0.030±0.010 0.002±0.001 IL-6（ng／mL）關節(jié)液 4.080±2.370 1.290±1.030血清0.053±0.021 0.034±0.012

續(xù)表3 兩組關節(jié)液和血清中IL-1、IL-6和TNF-α的水平比較（ ±s）

續(xù)表3 兩組關節(jié)液和血清中IL-1、IL-6和TNF-α的水平比較（ ±s）

項目 JIA組（n＝58） 對照組（n＝46）TNF-α（ng／mL）關節(jié)液 0.046±0.017 0.013±0.005血清0.028±0.011 0.010±0.006

表4 JIA組關節(jié)液中IL-1與 MMP-1和TIMP－1相關性分析

3 討 論

JIA是兒童時期常見的自身免疫病，該疾病發(fā)病機制仍有待研究。MMP由于其能夠分解Ⅱ型膠原蛋白，被認為在該疾病中起到重要作用［10－11］。MMP由正常組織或腫瘤細胞合成，需要Ca2＋、Zn2＋等金屬離子作為輔助因子，可降解多種細胞外基質成分。目前研究認為在26種MMP中，與骨關節(jié)炎軟骨降解關系最為密切的為MMP-1與 MMP-3。關節(jié)的損傷是不可逆的，JIA中Ⅱ型膠原蛋白的損傷導致關節(jié)生長面的損傷，該損傷為JIA的特征之一。大部分JIA患者關節(jié)液中可檢出MMP-1，且與PLT密切相關，提示MMP在JIA中與炎癥具有一定相關性。本研究結果表明JIA患者血清中 MMP-1與MMP-3的濃度非常低，檢出困難，而 MMP-1和 MMP-3在JIA患者關節(jié)液中濃度較高，同時，一些炎性因子在血清中檢出濃度較高，提示MMP無法作為血清中JIA的檢驗標志物，但血清中炎癥因子的高表達可以提示JIA疾病的發(fā)生。

文獻報道，MMP-3能夠降解蛋白多糖，而更為重要的是，它能 夠 激 活 其 他 pro-MMP，包 括 MMP-1［12］。 本 研 究 中，MMP-3在關節(jié)液中濃度達83.16ng／mL，提示 MMP-3可能激活其他MMP，形成正反饋，從而極大地惡化JIA疾病進程。

TIMP-1作為 MMP-3的特異性 抑制因子［13－14］，在生理 狀態(tài)下，MMP∶TIMP-1處于一種平衡狀態(tài)，有文獻報道，TIMP-1的水平的升高和MMP的生成量的增長一致。但病理條件下，該動態(tài)平衡被打破，TIMP-1的水平低于 MMP的生成，甚至TIMP-1的水平明顯降低而 MMP卻明顯升高，導致關節(jié)軟骨嚴重破壞。

細胞因子通過組織纖溶酶原途徑調節(jié)MMP的活性。文獻報道，TNF-α能夠上調IL-6［15－16］，而IL-6則下調 MMP-13。IL-1促進 MMP的合成而抑制 TIMP-1產(chǎn)生過程［17－18］，介導了MMP與TIMP-1系統(tǒng)的失衡，對關節(jié)軟骨的分解起到推動作用。這與本結果一致，在JIA患者血清中檢測到TNF-α、IL-1與IL-6的高表達，同時檢測到TIMP-1的濃度降低。通過相關性分析，也發(fā)現(xiàn)IL-1與 MMP-1呈正相關，而與TIMP-1呈負相關。

綜上所述，本結果提示，在對JIA的治療中，應加強對細胞因子的調控。采用藥物降低IL-1的水平，從而抑制 MMP的表達；可采用抗體類藥物中和IL-1，同時提高TIMP-1的表達，抑制MMP，保護關節(jié)軟骨；或者采用IL-1的競爭性抑制劑，使IL-1的作用降低甚至完全被拮抗。目前已有研究表明IL-1抑制劑canakinumab和IL-6抑制劑tocilizumab用于治療全身型JIA，但仍需要納入更多全身性JIA患者接受IL-1或IL-6抑制劑藥物治療的試驗［19］。以前，雖然甲氨蝶呤和TNF-α抑制劑可以用于JIA治療，但嚴重的青少年或兒童全身性JIA患者均無有效的治療選擇。本結果對于JIA的治療提出新的理論依據(jù)，但同時也需要更為深入的基礎和臨床研究來驗證這些可能性。

［1］Kunjir V，Venugopalan A.Profile of Indian patients with juvenile onset chronic inflammatory joint disease using the ILAR classification criteria for JIA：a community-based cohort study［J］.J Rheumatol，2010，37（8）：1756-1762.

［2］Stabile A，Avallone L，Compagnone A，et al.Focus on juvenile idiopathic arthritis according to the 2001Edmonton revised classification from the International League of Associations for Rheumatology：an Italian experience［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2006，10（5）：229-234.

［3］Sim KT，Venning HE，Barrett S，et al.Extended oligoarthritis and other risk factors for developing JIA-associated uveitis under ILAR classification and its implication for current screening guideline［J］.Ocul Immunol Inflamm，2006，14（6）：353-357.

［4］Southwood TR.Paediatric rheumatic disease：Treatment of JIA in the biologic era：what are we waiting for［J］.Nat Rev Rheumatol，2014，10（3）：132-134.

［5］Pastore S，Gortani G，Taddio A，et al.Procedural sedation for intra-articular corticosteroid injections in juvenile idiopathic arthritis（JIA）should be a standard of care［J］.Eur J Pediatr，2014，173（6）：831.

［6］Wan J，Yin Y，Sun R，et al.Protective effect of the ultrafiltration extract from Xin Mai Jia on human aortic smooth muscle cell injury induced by hydrogen peroxide［J］.Exp Ther Med，2014，7（1）：11-16.

［7］Koos B，Tzaribachev N，Bott S，et al.Classification of temporomandibular joint erosion，arthritis，and inflammation in patients with juvenile idiopathic arthritis［J］.J Orofac Orthop，2013，74（6）：506-519.

［8］Abramowicz S，Susarla HK，Kim S，et al.Physical findings associated with active temporomandibular joint inflammation in children with juvenile idiopathic arthritis［J］.J Oral Maxillofac Surg，2013，71（10）：1683-1687.

［9］Gaspari S，Marcovecchio ML，Breda L，et al.Growth in juvenile idiopathic arthritis：the role of inflammation［J］.Clin Exp Rheumatol，2011，29（1）：104-110.

［10］Sarma PK，Misra R，Aggarwal.Elevated serum receptor activator of NF kappaB ligand （RANKL），osteoprotegerin（OPG），matrix metalloproteinase （MMP）3，and ProMMP1in patients with juvenile idiopathic arthritis［J］.Clin Rheumatol，2008，27（3）：289-294.

［11］Peake NJ，Khawaja K，Myers A，et al.Levels of matrix metalloproteinase（MMP）-1in paired sera and synovial fluids of juvenile idiopathic arthritis patients：relationship to inflammatory activity，MMP-3and tissue inhibitor of metalloproteinases-1in a longitudinal study［J］.Rheumatology（Oxford），2005，44（11）：1383-1389.

［12］Hasty KA，Reife RA，Kang AH，et al.The role of stromelysin in the cartilage destruction that accompanies inflammatory arthritis［J］.Arthritis Rheum，1990，33（3）：388-397.

［13］Wang ZZ，Wang Y，Li JM，et al.Significance of serum MMP-3，TIMP-1，and monocyte CD147in rheumatoid arthritis patients of damp-heat Bi-syndrome and of colddamp Bi-syndrome［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2013，33（6）：770-773.

［14］Wang GW，Wang MQ，Wang XJ，et al.Changes in the expression of MMP-3，MMP-9，TIMP-1and aggrecan in the condylar cartilage of rats induced by experimentally created disordered occlusion［J］.Arch Oral Biol，2010，55（11）：887-895.

［15］Daniele G，Guardado Mendoza R，Winnier D，et al.The inflammatory status score including IL-6，TNF-alpha，osteopontin，fractalkine，MCP-1and adiponectin underlies whole-body insulin resistance and hyperglycemia in type 2 diabetes mellitus［J］.Acta Diabetol，2014，51（1）：123-131.

［16］Putra AB，Nishi K，Shiraishi R，et al.Jellyfish collagen stimulates production of TNF-alpha and IL-6by J774.1 cells through activation of NF-kappaB and JNK via TLR4 signaling pathway［J］.Mol Immunol，2014，58（1）：32-37.

［17］Nee L，O′Connell S，Nolan S，et al.Nitric oxide involvement in TNF-alpha and IL-1beta-mediated changes in human mesangial cell MMP-9and TIMP-1［J］.Nephron Exp Nephrol，2008，110（2）：e59-66.

［18］Nee L，Tuite N，Ryan MP，et al.TNF-alpha and IL-1beta-mediated regulation of MMP-9and TIMP-1in human glomerular mesangial cells［J］.Nephron Exp Nephrol，2007，107（2）：e73-86.

［19］Sandborg C，Mellins ED.A new era in the treatment of systemic juvenile idiopathic arthritis［J］.N Engl J Med，2012，367（25）：2439-2440.

R684.3

B

1671-8348（2015）04-0524-03

10.3969／j.issn.1671-8348.2015.04.033

劉小惠（1975－），副主任醫(yī)師，碩士，主要從事風濕免疫工作。

2014-09-25

2014-10-18）

·論 著·