退行性主動(dòng)脈瓣脂肪因子chemerin的表達(dá)＊

謝 霆， 李儒正， 吳朝光， 張 紅， 陳新忠

1海南省人民醫(yī)院心臟外科，?？?570311

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022

退行性主動(dòng)脈瓣疾?。╠egenerative aortic valve disease，DAVD）是常見的成人瓣膜性心臟病，老年患者患病率最高，病變與動(dòng)脈粥樣硬化有一定的相似之處，損傷瓣膜組織可見脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞蓄積，還可見新生血管和鈣化灶［1］。隨著對(duì)脂肪因子研究的深入，大量證據(jù)表明脂肪細(xì)胞因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［2－3］，但脂肪因子在 DAVD中的作用研究資料較少。chemerin是2007年發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，在脂肪細(xì)胞中chemerin基因表達(dá)豐度高，能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)，還參與調(diào)節(jié)炎癥和鈣化［4－5］。因此，我們推測(cè)脂肪因子chemerin可能在DAVD中表達(dá)。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象

收集2012年10月至2013年10月在海南省人民醫(yī)院心臟外科因DAVD行手術(shù)切除的主動(dòng)脈瓣標(biāo)本30例，男17例，女13例，年齡（55±6）歲；夾層動(dòng)脈瘤行Bentall手術(shù)切除正常主動(dòng)脈瓣標(biāo)本7例，男4例，女3例，年齡（41±8）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：排除先天性主動(dòng)脈瓣畸形、風(fēng)濕性心臟瓣膜病、感染性心內(nèi)膜炎和馬凡綜合征，排除甲狀旁腺疾病和腎功能衰竭等影響鈣磷代謝，以及炎癥指標(biāo)C反應(yīng)蛋白和血沉升高的患者。所有組織標(biāo)本均根據(jù)《赫爾辛基宣言》經(jīng)患者及家屬知情同意后采集，研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1．2 方法

1．2．1 主動(dòng)脈瓣膜的取材 觀察瓣膜標(biāo)本后剪掉瓣膜基底部和尖部，選取瓣膜中部，一部分瓣膜用蘇木精－伊紅（HE）染色分析；一部分瓣膜用于免疫組織化學(xué)（IHC）染色分析。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、5μm連續(xù)切片。

1．2．2 標(biāo)本HE染色 所有標(biāo)本經(jīng)我院病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的技師行常規(guī)HE染色，觀察瓣膜的組織結(jié)構(gòu)，包括瓣葉的厚度、炎癥細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管和鈣化。

1．2．3 IHC染色 兔抗人chemerin多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）按1∶100稀釋，石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)后，采用PV－9000通用型二步法試劑盒操作，具體操作按試劑盒操作說明。

1．2．4 IHC染色圖像分析 其中有8例標(biāo)本因?yàn)殁}化嚴(yán)重標(biāo)本染色后無法觀察到完整鈣化灶和1例瓣膜未見到陽性表達(dá)而被排除，最后總共21例標(biāo)本納入圖片分析。IPP（Image－Pro Plus）軟件測(cè)量瓣膜鈣化面積和鈣化周圍（鈣周2mm區(qū)域）chemerin蛋 白 的 累 積 光 密 度 （integrated optical density，IOD），每個(gè)納入IPP圖片分析的標(biāo)本，鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍（×400）視野測(cè)量后選取平均值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；鈣化面積和鈣化周圍chemerin表達(dá)的累積光密度相關(guān)性分析采用單元線性回歸分析，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 瓣膜肉眼觀察

正常的瓣葉呈半透明狀，柔韌性好。DAVD表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣口狹窄，瓣葉明顯增厚、堅(jiān)硬，鈣化結(jié)節(jié)形成，累及瓣葉的基底部、中間部和瓣尖，鈣化結(jié)節(jié)均主要位于主動(dòng)脈側(cè)，可見不同程度的脂肪組織。

2．2 HE染色結(jié)果

正常的瓣葉主要由5層構(gòu)成，依次為：單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的主動(dòng)脈側(cè)內(nèi)皮層、富含膠原纖維的膠原層、致密基質(zhì)較少并排列疏松的松質(zhì)層、有明顯彈力纖維的心室層和單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的心室側(cè)內(nèi)皮層。正常瓣膜中無血管，無炎性細(xì)胞浸潤（圖1A）。DAVD瓣葉損傷內(nèi)膜下可見膠原纖維增生、排列紊亂，可見泡沫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、新生毛細(xì)血管和鈣化灶（圖1B、1C）。

2．3 脂肪因子chemerin IHC染色

正常瓣膜的7例標(biāo)本未見chemerin陽性表達(dá)（圖2A）；DAVD 瓣 膜 可 見，chemerin在29 例（96．7%）標(biāo)本胞質(zhì)和胞膜中陽性表達(dá)，免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒（圖2B、2C），1例（3．33%）chemerin陰性表達(dá)，正常瓣膜與DAVD瓣膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．4 IHC染色圖像分析

IPP分析顯示我們選擇標(biāo)本中chemerin蛋白的IOD值隨著鈣化結(jié)節(jié)的面積增加而增大，單元線性回歸分析表明chemerin表達(dá)與鈣化面積呈正相關(guān)（r＝0．985，P＜0．05）。見圖3。

3 討論

DAVD在老年人中較為常見，目前尚無有效的藥物治療方法可以防止或逆轉(zhuǎn)DAVD，外科手術(shù)或經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈瓣置換術(shù)是唯一有效治療本病的手段。瓣膜長期暴露在血流沖擊和血液脂質(zhì)等介質(zhì)的接觸下，正常組織結(jié)構(gòu)容易遭受破壞，導(dǎo)致血脂積累，炎性細(xì)胞浸潤，纖維增生，血管生成，最終瓣膜鈣化。目前認(rèn)為DAVD是主動(dòng)鈣化過程，涉及到極其復(fù)雜的過程，脂質(zhì)被認(rèn)為是促發(fā)因素［6］。在DAVD瓣膜標(biāo)本可見脂肪組織在鈣化灶周圍，顯微鏡觀察顯示DAVD瓣膜標(biāo)本鈣化周圍可見到富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。

圖1 瓣膜組織的蘇木精－伊紅染色圖片F(xiàn)ig．1 HE staining of valve tissues

圖2 瓣膜組織脂肪因子chemerin IHC染色Fig．2 IHC staining of chemerin in valves

圖3 退行性主動(dòng)脈瓣chemerin表達(dá)與鈣化面積的相關(guān)性Fig．3 Relationship between the area of calcification and the expression of chemerin protein in degenerative aortic valves

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為脂肪組織是一種終末分化的能量貯備器官，僅僅起著貯存中性脂肪、供應(yīng)能量、減震以及調(diào)節(jié)體溫等作用，然而近20年來研究證實(shí)脂肪組織能夠生成和分泌大量的細(xì)胞因子、生長因子和活性肽等（統(tǒng)稱為脂肪因子），它們以旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌的方式作用于遠(yuǎn)隔或鄰近器官組織，在能量代謝、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)脂肪因子也參與鈣化的發(fā)生發(fā)展。脂肪因子瘦素和腫瘤壞死因子α在體內(nèi)外均可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化及鈣化，而脂肪因子脂聯(lián)素、網(wǎng)膜素則可抑制鈣化，提示各脂肪因子可能在鈣化過程中以協(xié)同或拮抗的方式發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，構(gòu)成促鈣化和抑鈣化的復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［2］。目前脂肪因子與鈣化的研究多聚焦于血管鈣化，關(guān)于脂肪因子與瓣膜鈣化的文獻(xiàn)國內(nèi)外未見報(bào)道，本文嘗試研究脂肪因子在瓣膜鈣化中的表達(dá)。

chemerin是2007年發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，在脂肪細(xì)胞高度表達(dá)，經(jīng)過金屬蛋白酶、蛋白水解酶、凝血酶等多種酶分解后產(chǎn)生活性［7］，活性的chemerin能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、脂肪代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)［8－10］。chemerin 具 有 2 個(gè) 功 能 不 同 的 配 體，CMKLR1和CCRL2；其中CMKLR1在炎癥細(xì)胞中表達(dá)豐度較高。CCRL2結(jié)合chemerin后增加局部chemerin濃度并呈遞chemerin給附近表達(dá)CMKLR1的炎癥細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移［4，11］，本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本檢測(cè)表明在DAVD瓣膜鈣化周圍的炎癥細(xì)胞區(qū)域是chemerin陽性表達(dá)的區(qū)域，而正常瓣膜未見chemerin陽性表達(dá)，我們推測(cè)可能是DAVD由于脂質(zhì)蓄積，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的同時(shí)表達(dá)chemerin，促進(jìn)了血液中的炎癥細(xì)胞向瓣膜遷移和蓄積，或者是血液中的chemerin伴隨脂質(zhì)蓄積在DAVD瓣膜中，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞向瓣膜遷移。最近的研究表明chemerin參與鈣化，若用抗體中和chemerin能夠阻斷鈣化過程中重要細(xì)胞因子NFATc1（活化T細(xì)胞核因子1）的活化［5］，這提示chemerin可能促進(jìn)瓣膜鈣化。

總之，我們首次發(fā)現(xiàn)脂肪因子在DAVD中表達(dá)，拓展了我們的認(rèn)知，DAVD中chemerin表達(dá)明顯增高，而正常瓣膜未見chemerin表達(dá)，根據(jù)以前的研究，初步推斷chemerin可能促進(jìn)瓣膜鈣化，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

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