老年人口腔細(xì)胞角蛋白與口腔扁平苔蘚關(guān)系的臨床研究

[摘要] 目的 探討老年患者口腔CK與OLP的相關(guān)性，為臨床的疾病診斷和制定治療方案提供依據(jù)。 方法 32例病例樣本來(lái)源于我院口腔科經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)確診的OLP患者頰部病變組織，為研究組；另取同期口腔拔牙患者健康口腔黏膜組織30例，為對(duì)照組；進(jìn)行樣本制備和垂直電泳處理，觀察兩組樣本的CK陽(yáng)性情況。 結(jié)果 研究組患者CK2、CK4和CK5陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，而研究組CK10、CK13和CK14的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 口腔細(xì)胞角蛋白與口腔扁平苔蘚的發(fā)病有一定相關(guān)性，CK2、CK4、CK5的淺表達(dá)和CK10、CK13、CK14的過(guò)表達(dá)，影響上皮細(xì)胞組織的增殖、分裂、角化等，進(jìn)而影響OLP的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞] 老年患者；口腔細(xì)胞角蛋白；口腔扁平苔蘚；相關(guān)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R781.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）25-0149-02

老年人體質(zhì)差，易發(fā)生各類(lèi)口腔感染?？谇槐馄教μ\（OLP）是一種較為常見(jiàn)的口腔內(nèi)慢性非感染性病變，主要發(fā)病于口腔黏膜，表現(xiàn)為上皮的過(guò)度角化，可累及口腔頰、牙齒、舌等其他部位的黏膜組織，屬于免疫反應(yīng)性疾病的一類(lèi)[1]。目前臨床對(duì)OLP的治療比較困難，易反復(fù)且有惡性?xún)A向，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列入到癌前狀態(tài)范疇中。研究表明，細(xì)胞角蛋白（CK）與上皮角質(zhì)細(xì)胞的增殖具有相關(guān)性[2]。CK屬于角質(zhì)細(xì)胞中的骨架性蛋白，多于上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有組織分化的特異性和高度保守性[3]。為探討老年患者口腔CK與OLP的相關(guān)性，給臨床的疾病診斷和制定治療方案提供依據(jù)，早期遏制癌變，筆者選取我院自2011年6～12月間收集的OLP標(biāo)本共32例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

32例病例樣本來(lái)源于我院口腔科經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)確診的OLP患者頰部病變組織，為研究組，其中男18例，女14例；年齡60～82歲，平均（69.4±5.3）歲；排除服用激素類(lèi)藥物患者和有口腔黏膜病變者。另取同期口腔拔牙患者健康口腔黏膜組織30例為對(duì)照組，其中男15例，女15例，年齡60～78歲，平均（66.2±4.8）歲。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用北京天誠(chéng)活德生物技術(shù)有限公司提供的DYY-12C型號(hào)電泳儀，由同廠提供的DYCZ-30型夾芯式垂直電泳槽。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)由上海精密儀器儀表有限公司供應(yīng)，型號(hào)UV-3200PCGLP。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜由美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司生產(chǎn)。鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白（P-CK）單克隆抗體由上海麗臣生物科技有限公司供應(yīng)，配有ELISA試劑盒。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG由上海萬(wàn)安生物科技有限公司提供。DAB染色試劑盒由北京賽馳生物科技有限公司提供。

1.2.2 樣本制備 取兩組口腔黏膜標(biāo)本各分為2份，一份行病理學(xué)HE染色驗(yàn)證確診，一份行樣本制備與檢測(cè)。將口腔黏膜標(biāo)本置入濃度3 mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）無(wú)鈣鎂磷鹽緩沖液中，置于37℃環(huán)境下靜置2 h后取出，利用顯微外科組織鑷在10×4倍的觀察視野下分離上皮組織。分離后的上皮組織置入碾缽中，加入液氮研磨至粉末狀，再加入高鹽緩沖液1 mL，于4℃環(huán)境下勻漿1 h后，移入離心管進(jìn)行離心處理10 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，棄除上清液后，將沉淀物重懸于低鹽緩沖液中，繼續(xù)混勻攪拌，于4℃環(huán)境下移入離心管離心處理5 min，轉(zhuǎn)速5000 r/min，再次棄除上清液，將沉淀物以PBS洗滌5 min，第3次離心，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，棄除上清液，沉淀物加入細(xì)胞角蛋白溶解液1 mL后于沸水浴中攪拌7 min，冷卻后再行離心，離心后上清液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白定量，蛋白濃度為2.5 μg/μL。

1.2.3 電泳 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，凝膠上的樣孔均勻分為兩份，各放入5個(gè)樣本，兩份樣本一一對(duì)應(yīng)。兩份凝膠一份使用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色處理后觀察色帶變化情況，另一份應(yīng)用Western雜交電泳處理，證實(shí)獲得蛋白條帶屬于角蛋白。各樣品槽內(nèi)加樣，濃縮膠5%，分離膠12%。電泳后將凝膠切取一半移至PVDF膜上，再使用封閉液封閉好，于4℃環(huán)境下靜置過(guò)夜，次日加入抗CK抗體，靜置于4℃環(huán)境下過(guò)度，再以PBST液洗滌PVDF膜，反復(fù)3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶，二抗標(biāo)記，置于37℃環(huán)境下行2 h振蕩，取出后用PBST洗滌PVDF膜，反復(fù)3次，參照DAB染色試劑盒的相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行顯色處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

獲得數(shù)據(jù)錄入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS15.0中并建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

分別對(duì)研究組和對(duì)照組檢驗(yàn)樣本中CK陽(yáng)性率進(jìn)行比較，兩組計(jì)數(shù)資料CK2、CK4和CK5、 CK10、CK13和CK14分別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，見(jiàn)表1，研究組患者CK2、CK4和CK5陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，而研究組CK10、CK13和CK14的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

OLP的病理改變與CK的變化密切相關(guān)。李寧等[4]研究指出，基底層細(xì)胞凋亡過(guò)程中角質(zhì)形成細(xì)胞形成嗜伊紅小體，尤以O(shè)LP基底膜破壞區(qū)域、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域、上皮T細(xì)胞侵入?yún)^(qū)域等更為明顯?；准?xì)胞可通過(guò)將抗原提呈給細(xì)胞毒性T細(xì)胞促成角質(zhì)形成細(xì)胞形成免疫損傷的靶細(xì)胞，從而降低黏膜上皮的自我修復(fù)能力，促進(jìn)OLP的形成及進(jìn)展。CK主要于上皮組織細(xì)胞表達(dá)，屬于細(xì)胞中間絲的主要成分，研究認(rèn)為其具有高度的組織和細(xì)胞特異性[5]。

CK2是二型細(xì)胞角蛋白，簡(jiǎn)潔等[6]報(bào)道口腔黏膜中的角化上皮和非角化上皮一般情況下較少出現(xiàn)在CK2的表達(dá)。Presland等[7]研究OLP中未發(fā)現(xiàn)CK2的表達(dá)。在本組研究中，研究組的CK2無(wú)表達(dá)，對(duì)照組的CK2表達(dá)陽(yáng)性率僅20%，與相關(guān)報(bào)道相符，提示在正常口腔黏膜組織中可能存在不穩(wěn)定CK2，但OLP可能引起DK2的表達(dá)減少甚至是消失。CK4屬于上皮分層和非角化標(biāo)志，一般和CK13形成角蛋白對(duì)，于口腔上皮組織中呈現(xiàn)。CK5屬于基底層標(biāo)志，一般是與CK14呈現(xiàn)角蛋白對(duì)，二者可形成彈性纖維網(wǎng)，從而適應(yīng)細(xì)胞分裂以及組織形成變化，為細(xì)胞的形變提供環(huán)境。在本組研究中，CK4、CK5在研究組中的表達(dá)均極少，在對(duì)照組中表達(dá)相對(duì)多，與CK2的表達(dá)相似，筆者認(rèn)為可能是OLP的進(jìn)展引起CK4和CK5的減少或消失。CK2、CK4、CK5在OLP中表達(dá)不足可作為臨床研究的一種現(xiàn)象，但其消失過(guò)程及誘因等仍需進(jìn)一步的臨床深入研究。

CK10、CK13和CK14是目前對(duì)OLP研究中較為關(guān)注的幾種角蛋白，毛良軍[8]直接對(duì)該三種CK的顯微鏡下表現(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，并指出該三種CK表達(dá)的變化與OLP病灶的角化、增殖和分化有關(guān)。CK10作為角化標(biāo)志，在角化復(fù)層的鱗狀上皮基底層中表達(dá)，在細(xì)胞角化的過(guò)程中產(chǎn)生變化。CK10過(guò)度表達(dá)可能會(huì)致使上皮細(xì)胞的角化和分化，在本組研究中研究組DK10陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，提示CK10在OLP中存在過(guò)度表達(dá)，可能也是引發(fā)OLP發(fā)病及進(jìn)展的因素之一。CK13屬于細(xì)胞分層與分化的標(biāo)志，主要于頰黏膜上皮的基底組織上層表達(dá)，臨床可通過(guò)CK13的表達(dá)了解上皮組織的分化與成熟情況。在本組研究中，研究組CK13陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，提示CK13的表達(dá)過(guò)度可能影響OLP上皮細(xì)胞的分化與分層。CK14屬于基底層的標(biāo)志，主要集中表現(xiàn)在基底層細(xì)胞中，由于基底層細(xì)胞具有較高的分裂與增殖能力，因而CK14的變化可表達(dá)細(xì)胞分裂增殖的能力與程度。在本組中研究組CK14陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，提示CK14的過(guò)度表達(dá)可能影響到OLP上皮細(xì)胞加強(qiáng)增殖與分裂，從而引發(fā)病變或加重病情。

總之，口腔細(xì)胞角蛋白與口腔扁平苔蘚的發(fā)病有一定相關(guān)性，CK2、CK4、CK5的淺表達(dá)和CK10、CK13、CK14的過(guò)表達(dá)，影響上皮細(xì)胞組織的增殖、分裂、角化等，進(jìn)而影響OLP的發(fā)病。當(dāng)然，CK與OLP相關(guān)性之間的病理因素仍需要進(jìn)一步研究獲得。

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