肺血栓栓塞癥患者血小板RhoGTP酶相關(guān)mRNA差異性表達特征

[摘要] 目的 檢測分析肺血栓栓塞癥（PTE）患者血小板Rho GTP酶相關(guān)mRNA表達水平，分析其差異表達的意義。 方法 隨機取選20例PTE患者為PTE組；20例年齡、性別與之匹配的非PTE患者為對照組，提取外周血單個核細胞總RNA，采用人類全基因組表達譜芯片比較兩組PTE患者血小板Rho GTP酶mRNA表達的差異，并進行FQ-PCR驗證芯片的可靠性。 結(jié)果 檢測出血小板Rho GTP酶相關(guān)基因mRNA 11條，兩組比較，PTE組mRNA表達有3條（Rho GTP酶Rac1蛋白及其鳥嘌呤核苷酸交換因子Vav1、Vav3）高于對照組，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 PTE組中部分血小板Rho GTP酶相關(guān)基因mRNA表達顯著上調(diào)，提示血小板功能部分活化。

[關(guān)鍵詞] 肺血栓栓塞癥；基因芯片；血小板；Rho GTP酶

[中圖分類號] R563.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）24-0004-03

肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）和深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）。其中PTE的高發(fā)病率、誤診率及死亡率已經(jīng)成為全球的重要醫(yī)療保健問題[1]。動脈血栓是白色血栓，抗血小板藥物在動脈血栓疾病的治療中發(fā)揮重要作用。靜脈血栓是紅色血栓，血栓內(nèi)富有紅細胞、白細胞、血小板和纖維蛋白原[2]。血栓形成的過程中，血小板在黏附、聚集和顆粒釋放環(huán)節(jié)發(fā)揮不同的作用[1]。而胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Rho GTP酶（the Rho family of GTP binding proteins），尤其是其成員RhoA、Cdc42和Rac1，在血小板激活以及產(chǎn)生各種細胞功能的過程中起著重要作用。在本研究中利用人類全基因組表達譜芯片檢測血小板Rho GTP酶相關(guān)mRNA在PTE中的差異表達，探討血小板Rho GTP酶在靜脈血栓形成過程中的作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料

隨機選取2007年5月～2008年8月上海市同濟醫(yī)院確診的20例PTE患者為PTE組。另選擇性別、年齡匹配的對照組20例，為同期入院患者，排除凝血功能異常、服用激素或免疫抑制劑、動靜脈血栓等病例。

1.2 檢測方法

1.2.1 總RNA分離 在確診后，使用阿司匹林、肝素等抗凝藥物之前，ETDA抗凝管留取兩組患者靜脈血各5 mL，離心、紅細胞裂解分離血總單個核細胞，Trizol法提取總RNA，電泳、紫外分光光度計及Lab-on-chip檢測鑒定總RNA質(zhì)量，合格RNA進一步純化用于芯片雜交。

1.2.2 芯片與雜交 兩組均進行逐一表達譜芯片分析。通過總RNA合成cDNA，熒光標記合成cRNA探針，標記的cRNA與全人類基因組芯片雜交，洗滌，掃描芯片雜交圖像。

1.2.3 FQ-PCR反檢測 隨機抽取部分基因行FQ-PCR驗證基因芯片可靠性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采集芯片原始數(shù)據(jù)信號值，平均標準化處理，得到標準化基因信號強度。計量資料以（x±s）表示，將兩組信號強度進行兩類樣本比較隨機方差參數(shù)t檢驗，篩選差異基因，差異篩選標準P < 0.05。

2 結(jié)果

血小板Rho GTP酶相關(guān)分子基因芯片檢測結(jié)果如下：共篩選出血小板Rho GTP酶相關(guān)分子基因mRNA 11條，兩組基因mRNA平均信號值見表1。其中，血小板Rho GTP酶基因mRNA 3條（RHOA、RAC1、CDC42），其中，1條（RAC1）較對照組顯著上調(diào)（P < 0.01），其余2條無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05），見圖1。血小板Rho GTP酶激活蛋白（Rho GAPs）基因mRNA 3條（ARHGAP6、OPHN1、IQGAP2），3條均無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05），見圖2。血小板Rho GTP酶鳥嘌呤核苷酸交換因子（Rho GEFs）基因mRNA 5條（RGNEF、PREX1、VAV1、VAV2、VAV3），其中2條（VAV1、VAV3）較對照組顯著上調(diào)（P < 0.01），其余3條無統(tǒng)計學(xué)差異（P >0.05），見圖3。在11條血小板Rho GTP酶相關(guān)分子基因mRNA中，共有3條存在組間統(tǒng)計學(xué)差異，約占27.3%。

3 討論

Rho GTP酶屬于Ras GTP酶超家族成員，在人體中存在著20余種Rho GTP酶，它們的主要作用是通過傳遞各種細胞內(nèi)信號，參與細胞活動，從而使細胞產(chǎn)生多種多樣的功能，例如細胞極性的形成、細胞形態(tài)改變、細胞遷移、胞內(nèi)囊泡運輸、細胞凋亡等[1]。血液白細胞中的Rho GTP酶主要包括Rap1、RhoG等[5，6]，而存在于血小板中的Rho GTP酶主要是RhoA、Cdc42以及Rac1三種蛋白，它們在血小板激活的各個環(huán)節(jié)，包括聚集、顆粒分泌、擴展、血塊收縮和血栓形成等都起著至關(guān)重要的作用[7]。

Rho GTP酶RhoA、Cdc42和Rac1在體內(nèi)存在激活的GTP綁定和滅活的GDP綁定兩種狀態(tài)。兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換受到特定的激活蛋白（Rho GAPs，GTPase activating proteins）和鳥嘌呤核苷酸交換因子（Rho GEFs，Guanine nucleotide exchange factors）的動態(tài)調(diào)節(jié)[8]，Rho GAPs加快Rho GTP酶從GTP綁定狀態(tài)向GDP綁定狀態(tài)水解，使得Rho GTP酶向下游的信號傳導(dǎo)受抑制，其中ARHGAP6是RhoA特異性的激活蛋白，而Oligophrenin1（基因簡稱OPHN1）和IQGAP2則對應(yīng)調(diào)節(jié)Rac1/Cdc42[9]。

Rho GEFs催化Rho GTP酶從GDP綁定狀態(tài)向GTP綁定狀態(tài)轉(zhuǎn)換，使得Rho GTP酶能進一步激活下游效應(yīng)分子及多種信號通路，最終使血小板肌動蛋白重組，細胞骨架發(fā)生變化，乃至完全激活[10]。其中，p190Rho GEF（基因簡稱RGNEF）、P-Rex1分別是RhoA、Rac1特異性的鳥嘌呤核苷酸交換因子，而Vav1、Vav2、Vav3對上述3種Rho GTP酶均有催化作用，但對Rac1的特異性較高[11]。

在本研究中，3條Rho GTP酶基因mRNA中僅有1條（Rac1）較對照組表達顯著上調(diào)。Rho GTP酶Rac1在血小板激動劑膠原、凝血酶和纖維蛋白原等刺激下激活，通過一系列下游信號，調(diào)節(jié)血小板細胞骨架改變，使得血小板形成板狀偽足，而板狀偽足的形成是血小板擴展到膠原、纖維蛋白原、VWF和層粘連蛋白等表面的先決條件。相應(yīng)的Rho GAPs和Rho GEFs基因mRNA中也僅有對Rac1特異性較高的Vav1、Vav3表達較對照組顯著上調(diào)，據(jù)此推測，在受到上游信號刺激后，Rho-GTP酶Rac1蛋白高水平表達，且Vav1、Vav3蛋白的高表達意味著Rac1蛋白可能持續(xù)處在激活的GTP狀態(tài)，繼而激動下游信號分子，最終造成肌動蛋白重構(gòu)，血小板細胞骨架形態(tài)發(fā)生變化，伸出板狀偽足，能在相應(yīng)血小板激動劑表面形成附著，初步形成松散的血栓結(jié)構(gòu)。

Rho GTP酶Cdc42在血小板形成絲狀偽足及顆粒分泌過程中起著關(guān)鍵作用，缺乏Cdc42的血小板顆粒分泌及絲狀偽足生成減少，血小板募集的級聯(lián)反應(yīng)程度低，血小板在表面的擴展尤其是血小板之間的聚集受到影響。RhoA主要調(diào)節(jié)血小板的收縮以及血栓的穩(wěn)定性。在GDP綁定狀態(tài)，RhoA使得血小板在表面擴展蔓延，在GTP綁定狀態(tài)，則促使血塊收縮并部分促進顆粒分泌。在本研究中，Rho GTP酶RhoA、Cdc42及其相應(yīng)的Rho GAPs、Rho GEFs基因mRNA表達較對照組無顯著差異，說明Rho GTP酶RhoA、Cdc42蛋白表達量及活性較對照組無明顯差異，部分激活的血小板之間可能并沒有形成緊密的絲狀偽足連接，顆粒分泌、血小板再募集也部分受到影響，血小板蔓延、擴展和血塊收縮并不充分，因而形成的血栓結(jié)構(gòu)并不緊密。

血小板激活的信號傳導(dǎo)是一個雙向的、復(fù)雜的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)[12]?？寡“逅幬锬軠p少動脈血栓事件，表明血小板在動脈血栓形成過程中具有重要作用。Hovens等[13]報道的大規(guī)模臨床試驗證明，單獨使用抗血小板藥物預(yù)防及治療靜脈血栓，其效果難以期待。

本試驗通過對血小板Rho GTP酶相關(guān)mRNA的研究表明，在PTE過程中血小板的激活是不充分的，在靜脈血栓過程中，血小板并沒有完全地黏附、聚集、釋放、伸展和形成血塊收縮等，可能也是靜脈血栓不同于動脈血栓的地方。因此，對于靜脈血栓形成過程中血小板的激活機制和靜脈血栓的防治還有待進一步研究。

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（收稿日期：2013-05-17）