中藥秦艽提取物抑制人晶狀體上皮細(xì)胞遷移的研究

[摘要] 目的 為了驗(yàn)證中藥秦艽提取物抑制培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞遷移的作用，尋找防治后發(fā)障的新藥物。方法 晶狀體上皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，分別加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物，培養(yǎng)24 h，觀(guān)察細(xì)胞毒性，確定藥物的半數(shù)毒性濃度。細(xì)胞用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培養(yǎng)24 h。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照像，測(cè)出實(shí)驗(yàn)前后的細(xì)胞痕的寬度，計(jì)算出細(xì)胞遷移距離，測(cè)定藥物的半數(shù)有效濃度及計(jì)算秦艽提取物的治療指數(shù)。 結(jié)果 秦艽提取物半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為421.7 mg/L。以秦艽提取物濃度對(duì)數(shù)與遷移距離做回歸分析，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)為-0.966，有顯著性差異（P = 0.034）。秦艽提取物的半數(shù)有效治療濃度為0.38 mg/L。秦艽提取物治療指數(shù)為1110。 結(jié)論 秦艽提取物可抑制晶狀體上皮細(xì)胞的遷移，具有低毒、高效的特點(diǎn)，有望成為防治后發(fā)障的有效藥物

[關(guān)鍵詞] 秦艽提取物；晶狀體上皮細(xì)胞；遷移；后發(fā)障

[中圖分類(lèi)號(hào)] R776.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）24-0001-03

后發(fā)障是白內(nèi)障手術(shù)后二次致盲的主要原因，雖然Nd：YAG激光可治療，但存在多種并發(fā)癥，如黃斑囊樣水腫、視網(wǎng)膜脫離和眼壓升高等，因此，研究藥物防治后發(fā)障具有實(shí)際意義?？勾x藥雖可抑制后發(fā)障的發(fā)生，但其毒副作用較多。研究發(fā)現(xiàn)，中藥中有些具有抗炎作用的藥物可抑制細(xì)胞的增殖，但對(duì)抑制細(xì)胞遷移方面的報(bào)道較少。本文中，我們發(fā)現(xiàn)秦艽提取物可抑制培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞的遷移，有望成為防治后發(fā)障的有效藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

秦艽提取物。取秦艽，加8倍量水煎煮三次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，濾液在50℃～60℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.11～1.15，加乙醇使含醇量達(dá)80%，靜置12 h，濾過(guò)，回收乙醇至無(wú)醇味，加水稀釋至與藥材量之比為2∶1，靜置12 h，濾過(guò)，濾液加到已處理好的SP70大孔吸附樹(shù)脂柱，樹(shù)脂與藥材量之比為1∶1.5，依次用5%、40%乙醇溶液（5倍柱體積，2倍柱體積/h）梯度洗脫，收集40%乙醇洗脫液，減壓濃縮成稠膏，稠膏干燥，即得。

1.2 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液

人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA 01/04）由本單位張煒研究員惠贈(zèng)。F12/DMEM營(yíng)養(yǎng)液（Hyclone）；胎牛血清、Hepes液、胰蛋白酶/EDTA和D-Hanks液（Gibco）；L-Glu（Sigma）；青霉素、鏈霉素（華北制藥）。配制200 mL細(xì)胞培養(yǎng)液：F12/DMEM營(yíng)養(yǎng)液165～185 mL，血清10～30 mL，雙抗（青霉素2萬(wàn)U/mL，鏈霉素20 mg/mL）1 mL，L-Glu（200 mmol/L）1 mL，Hepes液2.5 mL。再加入胎牛血清，分別配成含血清為5%、10%和15%的細(xì)胞培養(yǎng)液備用。

1.3 人晶狀體上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

使用15%血清培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，加D-Hanks液沖洗，胰蛋白酶/EDTA（0.25%胰酶、0.03%EDTA）作用2 min，吸出消化液，加入營(yíng)養(yǎng)液，將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 藥物細(xì)胞毒性的測(cè)定

96孔培養(yǎng)板的細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，加D-Hanks液沖洗，分別加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物的營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，觀(guān)察細(xì)胞毒性，確定藥物的半數(shù)毒性濃度（IC50）。

1.5 比較不同濃度血清對(duì)細(xì)胞遷移的影響

96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入10%和5%的血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照像，測(cè)出實(shí)驗(yàn)前后的細(xì)胞痕的寬度，計(jì)算出細(xì)胞遷移距離。

1.6 秦艽提取物對(duì)細(xì)胞遷移的作用

96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入用含5%血清的營(yíng)養(yǎng)液配制濃度為100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照像，測(cè)出實(shí)驗(yàn)前后的細(xì)胞痕的寬度，計(jì)算出細(xì)胞遷移距離，計(jì)算秦艽提取物的半數(shù)有效濃度（EC50）和治療指數(shù)（TI）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，血清對(duì)細(xì)胞遷移距離影響采用t檢驗(yàn)，藥物濃度與遷移的關(guān)系采用回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 秦艽提取物的毒性

不同濃度的秦艽提取物對(duì)細(xì)胞的毒性見(jiàn)表1，藥物毒性隨濃度的減少而降低，半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（IC50）為421.7 mg/L。

2.2血清濃度對(duì)細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞培養(yǎng)液中不同血清濃度對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞遷移有一定的影響，24 h后，10%血清培養(yǎng)液細(xì)胞的遷移距離為（0.84±0.12），5%血清培養(yǎng)液細(xì)胞的遷移距離為（0.59±0.06），兩者有顯著性差異（P = 0.024），血清濃度越高，細(xì)胞遷移的距離越大。

2.3 秦艽提取物對(duì)細(xì)胞遷移的作用

加入藥物后24 h，以5%血清實(shí)驗(yàn)，秦艽提取物在藥物濃度為0、0.1、1、10和100 mg/L時(shí)，細(xì)胞遷移距離分別為0.61、0.53、0.45、0.14和0.06（圖1、2和3）。以秦艽提取物濃度對(duì)數(shù)與遷移距離做回歸分析，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)為 -0.966，有顯著性差異（P = 0.034）。通過(guò)計(jì)算得出，秦艽提取物的半數(shù)有效治療濃度（EC50）為0.38 mg/L。

2.4 藥物的治療指數(shù)（TI）

秦艽提取物治療指數(shù)（TI）為半數(shù)毒性濃度（IC50）/半數(shù)有效濃度，結(jié)果為1110。

3 討論

晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體中唯一細(xì)胞，是維持晶狀體功能的主要部分，它與囊膜一起共同保護(hù)晶狀體。正常情況下，晶狀體上皮細(xì)胞不斷向晶狀體內(nèi)部遷移，并轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞，形成晶狀體皮質(zhì)和晶狀體核。白內(nèi)障術(shù)后，由于細(xì)胞微環(huán)境的變化，使細(xì)胞產(chǎn)生增殖和遷移的傾向，結(jié)果造成后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生。

晶狀體上皮細(xì)胞從解剖位置上可分為兩種：赤道部細(xì)胞和前囊細(xì)胞。這兩種細(xì)胞在后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程中起不同的作用[1]，赤道部細(xì)胞具有遷移能力，可沿后囊膜與人工晶體之間空隙遷移到后囊膜的中心部位。如果空隙狹窄，這些細(xì)胞較平坦；如果空隙較寬，細(xì)胞變成球形結(jié)構(gòu)——珍珠樣小體；如果空隙更寬，珍珠樣小體可形成多層或巨型結(jié)構(gòu)。前囊細(xì)胞在撕囊后保留下來(lái)，表現(xiàn)出移行的能力，但更具有向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力，引起膠原的吸附和沉積，導(dǎo)致前囊膜皺縮，造成囊袋閉鎖。

后發(fā)障是白內(nèi)障手術(shù)的主要后遺癥，特別是兒童的后發(fā)障發(fā)病率還較高，為了減少后發(fā)障的發(fā)生，減輕患者的痛苦，研究防治后發(fā)障藥物很有必要。

秦艽是龍膽科多年生草本植物，是治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、結(jié)核病潮熱、黃疸等癥的主藥之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，“秦艽主寒熱邪氣，寒濕風(fēng)痹，肢節(jié)痛、下水、利小便”。實(shí)驗(yàn)研究顯示，秦艽提取物不但具有抗炎的作用[2]，而且還具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]和抗細(xì)菌[5]的作用。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，秦艽提取物對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞遷移有抑制作用，呈劑量相關(guān)性。另外血清濃度高，可促進(jìn)細(xì)胞遷移，我們選擇5%的血清營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。龍膽苦苷是秦艽提取物的主要成分，占總量的50%以上，但我們的研究顯示，龍膽苦苷對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的遷移無(wú)抑制作用，推測(cè)秦艽提取物抑制人晶狀體上皮細(xì)胞遷移的作用來(lái)源于藥物的其他成分。秦艽提取物抑制晶狀體上皮細(xì)胞的遷移的機(jī)制可能與影響細(xì)胞黏附分子功能有關(guān)[6]。

防治后發(fā)障的藥物只有進(jìn)入眼內(nèi)并作用于晶狀體上皮細(xì)胞才能起作用，可在手術(shù)中將藥物注射到前房，晶狀體上皮細(xì)胞遷移可被前房?jī)?nèi)注射的bFGF反義寡核苷酸抑制[7]，也可將藥物包裹在人工晶體上。Eibl等[8]將烷基磷酸膽堿包裹人工晶體植入眼內(nèi)，可顯著抑制晶狀體上皮細(xì)胞遷移，減少后發(fā)障的發(fā)生。

綜上，秦艽提取物毒性小，作用強(qiáng)，治療指數(shù)高，如用于臨床，可為防治后發(fā)障的發(fā)生提供新的藥物。

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（收稿日期：2013-05-21）