Kiss—1、β—catenin蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

[摘要] 目的 探討Kiss-1、β-catenin蛋白在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測86例PTC組織和15例正常甲狀腺組織中Kiss-1、β-catenin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 ①正常甲狀腺組織的Kiss-1陽性表達(dá)率顯著高于PTC（χ2=14.16，P < 0.01）；無伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC的Kiss-1陽性表達(dá)率顯著高于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（χ2=15.41，P < 0.01）；微小癌與非微小癌兩者的Kiss-1陽性表達(dá)率間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.47，P > 0.05）。②PTC的β-catenin異常表達(dá)率顯著高于正常甲狀腺組織（χ2=24.75，P < 0.01）；微小癌和非微小癌、伴有和無伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC間的β-catenin異常表達(dá)率的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2值分別為0.35和0.53，P > 0.05）。③Kiss-1陰性表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)正相關(guān)（spearman correlation value=0.56，P < 0.01）。 結(jié)論 β-catenin的異位表達(dá)很可能始于PTC發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段，Kiss-1表達(dá)的下調(diào)可能級聯(lián)增強(qiáng)了β-catenin的正向效應(yīng)作用，最終導(dǎo)致PTC的發(fā)生和頸部淋巴結(jié)的癌轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺腫瘤；Kiss-1；β-catenin

[中圖分類號] R714.246 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）22-0053-03

Kiss-1[1]是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的抑制基因，β-catenin降解障礙致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離β-catenin蓄積是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路致癌的關(guān)鍵所在[2]。甲狀腺乳頭狀癌（PTC）具有強(qiáng)烈的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，約有1/2患者初診時伴有頸部淋巴結(jié)腫大，很多臨床檢查淋巴結(jié)陰性的患者其實(shí)已存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)旨在分析這兩種腫瘤相關(guān)基因在PTC中的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2002年1月～2005年12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院術(shù)后病理確診的86例PTC病例（術(shù)前患者均未接受放療或化療）：男21例，女65例，年齡18～86歲，平均38歲，中位年齡33歲，其中微小癌（直徑<1 cm）61例，非微小癌25例；伴有頸部淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移者40例（A組），不伴轉(zhuǎn)移者46例（B組），另取結(jié)節(jié)性甲狀腺腫或?yàn)V泡性腺瘤標(biāo)本中盡量遠(yuǎn)離病變區(qū)的周圍正常甲狀腺組織15例作為對照組（C組）。所有患者的術(shù)后切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定10～12 h后取材，由全自動脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟，然后石蠟包埋制成蠟塊，對照HE切片隨機(jī)挑取含有較為豐富癌組織的PTC的蠟塊連續(xù)切片，待免疫組化染色備用。

1.2 方法

采用S-P免疫組化法染色。兔抗人Kiss-1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶120。一抗鼠抗人即用型單克隆抗體β-catenin（克隆號：MAB-0259）、通用型Ultrasensitive S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照，用已知陽性組織切片做陽性對照，嚴(yán)格照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判斷

由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法對免疫組化染色切片進(jìn)行觀察，Kiss-1以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性染色，每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野（×400），根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，分別對其中陽性細(xì)胞的比率和染色深度分別進(jìn)行評估，最后綜合評定，陽性細(xì)胞比例計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分；染色強(qiáng)弱計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，淡黃色染色為1分，中度黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。二者之積計(jì)總分：總分<3分為陰性（圖1），≥3分為陽性。β-catenin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞.細(xì)胞接觸側(cè)的胞膜上，β-catenin結(jié)果判斷參照Mayurama等[4]的方法，分別從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核判斷β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)特征，細(xì)胞膜β-catenin表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)>70%判定為正常表達(dá)，反之為表達(dá)缺失；細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核β-catenin表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)>10%（包括同時細(xì)胞膜表達(dá)>70%者）判定為異位表達(dá)，膜表達(dá)缺失或異位表達(dá)均稱為異常表達(dá)（圖2）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.5軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析亦采用χ2檢驗(yàn)中的相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常甲狀腺組織、PTC組織中Kiss-1蛋白的表達(dá)

15例正常甲狀腺組織均表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為100%；86例PTC組織中41例表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為47.67%，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.16，P < 0.01）。25例微小癌中8例表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為32%；61例非微小癌中33例表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為54.1%，兩者間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.47，P > 0.05）。40例伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC（A組）中10例表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為25%；46例無伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC（B組）中31例表達(dá)Kiss-1，陽性表達(dá)率為67.39%，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.41，P < 0.01）。見表1。

2.2 正常甲狀腺組織、PTC組織中β-catenin蛋白的表達(dá)

在正常甲狀腺組織中，β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，未見異常表達(dá)；86例PTC組織中59例異常表達(dá)β-catenin，異常表達(dá)率為68.60%，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.75，P < 0.01）。25例微小癌中16例異常表達(dá)β-catenin，異常表達(dá)率為64%；61例非微小癌中43例異常表達(dá)β-catenin，異常表達(dá)率為70.49%，兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.35，P > 0.05）。40例伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC（A組）中29例異常表達(dá)β-catenin，異常表達(dá)率為72.5%；46例無伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC（B組）中30例異常表達(dá)β-catenin，異常表達(dá)率為65.22%，兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.53，P > 0.05）。見表1。

2.3 PTC組織中Kiss-1、β-catenin蛋白表達(dá)的關(guān)系

45例Kiss-1表達(dá)陰性的PTC中，β-catenin異常表達(dá)者42例，正常表達(dá)者3例；41例Kiss-1表達(dá)陽性的PTC中，β-catenin異常表達(dá)者17例，正常表達(dá)者24例，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.80，P < 0.01），而且Kiss-1陰性表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)呈正相關(guān)（spearman correlation value=0.56，P < 0.01）。見表2。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺惡性腫瘤中的發(fā)病率最高，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其臨床特點(diǎn)是易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部浸潤，即使在微小癌階段。癌細(xì)胞從原發(fā)部位脫落作為浸潤和轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)，與細(xì)胞粘附功能降低密切相關(guān)。結(jié)合型β-catenin參與細(xì)胞間的黏附，它與E鈣黏蛋白形成復(fù)合體，再與肌動蛋白的細(xì)胞骨架相連，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞之間的緊密連接[5]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTC的β-catenin異位表達(dá)率顯著高于正常的甲狀腺組織，說明PTC癌細(xì)胞胞膜結(jié)合型β-catenin減少，進(jìn)入胞漿的游離型β-catenin增多，而后者是APC-β-cat-Tcf4/Lef信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，它可以通過核膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與DNA親和蛋白Tcf/Lef（T cell factor/lymphoid enhancer factor）結(jié)合，激活Wnt途徑靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，參與腫瘤形成[6]。但是β-catenin的異位表達(dá)率在微小癌和非微小癌、伴有和無伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見β-catenin的異位表達(dá)很可能始于PTC發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段，并且不斷地蓄積于細(xì)胞漿、進(jìn)而累積在細(xì)胞核引發(fā)細(xì)胞癌變。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是近年來關(guān)注的研究領(lǐng)域，Kiss-1在正常組織中，如心臟、腦、肺、胎盤、睪丸、胰腺、肝臟、腎臟、小腸等組織中都有不同水平的表達(dá)[7]，其編碼蛋白可與其受體GPR54結(jié)合引起一系列生理生化改變，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PTC組織的Kiss-1陽性表達(dá)率顯著低于正常甲狀腺組織，提示PTC的發(fā)生可能與Kiss-1的表達(dá)缺失有關(guān)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Kiss-1陽性表達(dá)率顯著低于無伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Kiss-1是影響PTC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素。然而Kiss-1陽性表達(dá)率在微小癌和非微小癌之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者的Kiss-1的陽性表達(dá)率均較低，這亦可成為一個解釋PTC即使在微小癌階段也極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原因的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。經(jīng)相關(guān)性分析得知PTC組織中Kiss-1的陰性表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)正相關(guān)，提示Kiss-1表達(dá)的下調(diào)可能級聯(lián)增強(qiáng)了β-catenin在Wnt信號通路的正向效應(yīng)作用，隨后引發(fā)一系列的基因突變，最終導(dǎo)致PTC的發(fā)生和頸部淋巴結(jié)的癌轉(zhuǎn)移。

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（收稿日期：2013-05-06）