不同耕作處理結(jié)合施肥、秸稈還田對土壤微生物多樣性的影響

摘 要：為了探索不同耕作處理對土壤耕層和犁底層微生物數(shù)量及其多態(tài)性的影響，對吉林省公主嶺周邊和長春農(nóng)安等地進(jìn)行田間試驗并采集土壤，通過室內(nèi)實驗對土壤進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及DGGE圖譜分析等研究。結(jié)果表明：不同耕作處理下，耕作層和犁底層土壤微生物均較農(nóng)民常規(guī)耕作下土壤微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性有所增加。通過DGGE圖譜條帶分析計算得出土壤香濃威爾多樣性指數(shù)（香濃指數(shù)），顯示在耕作層土壤中同一層面不同樣地的微生物種群結(jié)構(gòu)具有較高的相似性；不同樣地同一深度的犁底層土壤微生物種群結(jié)構(gòu)同樣具有較高的相似性。通過該試驗的研究最終得出結(jié)論：旋耕一體機(jī)配合作物根茬還田是增加土壤微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性的最佳組合方式。

關(guān)鍵詞：土壤微生物；PCR-DGGE；聚類分析；香濃威爾指數(shù)

中圖分類號 S15 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）24-65-04

在土壤養(yǎng)分循環(huán)的過程中，土壤微生物發(fā)揮著積極的作用，是土壤肥力的重要指標(biāo)[1]，土壤微生物幾乎是全部土壤生物化學(xué)過程的參與者，不但能提升土壤中有效養(yǎng)分的含量，還為作物生長和產(chǎn)量提供必要的物質(zhì)保障[2]。由于人們長期對土壤進(jìn)行農(nóng)事操作，改變了土壤物理生物化學(xué)屬性，因此對農(nóng)田土壤微生物的主要類群和重要功能群的數(shù)量影響也愈見強(qiáng)烈，進(jìn)而可能影響耕地質(zhì)量保育與生態(tài)環(huán)境安全[3-4]。大部分土壤微生物對耕作措施很敏感，會表現(xiàn)出不同的反應(yīng)[5-6]。其多樣性對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)力和應(yīng)對壓力與擾動的恢復(fù)力方面有著重要的影響[7]。Al-Kaisi和Liebig等研究都表明，保護(hù)性耕作較傳統(tǒng)耕作更有利于增加土壤中微生物多樣性和生物量且更集中于地表，進(jìn)而提高土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性。加之長期高強(qiáng)度的農(nóng)藥化肥大量投入使用也極易降低土壤中微生物群落多樣性，導(dǎo)致微生物功能喪失，進(jìn)一步影響土壤質(zhì)量，使得土壤障礙頻發(fā)[8-9]。研究結(jié)果表明恰當(dāng)?shù)墓芾碇贫饶軌蛟黾油寥牢⑸锓N群數(shù)量，進(jìn)而有利于作物產(chǎn)量的提高，土壤質(zhì)量也會隨之改善[10-11]。Schutter等利用PLFA法對保護(hù)性耕作和傳統(tǒng)耕作下土壤微生物多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對比傳統(tǒng)耕作，保護(hù)性耕作更能增加土壤微生物種群數(shù)量。

1993 年，Muy zer 等首次將PCR-DGGE（Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis）技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)的研究，這一技術(shù)的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的限制，由于PCR-DGGE 具有可靠、方便快捷、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，迅速成為微生物群落多樣性和動態(tài)分析的強(qiáng)有力工具[12]，它利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中G+C含量的rDNA組分在電泳凝膠中移動的位置上的差異，不同G+C含量在膠中移動的速度不同，因此產(chǎn)生不同代表微生物群落組成的條譜帶。本試驗通過測定不同耕作方式下土壤微生物數(shù)量以及在分子水平上利用PCR-DGGE技術(shù)研究不同耕作方式下的農(nóng)田管理措施對土壤微生物群落多樣性的影響，從理論上闡明適合的耕作方式和農(nóng)田管理模式，為土壤質(zhì)量的改善和生產(chǎn)力的提高，提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況 試驗在吉林省農(nóng)田進(jìn)行，試驗地土壤為典型黑土。全省大部分地區(qū)年平均氣溫為2～6℃，全年日照2 200～3 000h，年活動積溫平均在2 700～3 200℃，年降水量一般在400～1 300mm。受季風(fēng)氣候影響，吉林省四季降水量以夏季最多，占全年降水量的60%以上，對作物生長十分有利。

1.2 供試土壤與樣品采集 本研究選擇4種處理：（1）陶家子（TH）：玉米收割后根茬還田，次年旋耕四位一體機(jī)進(jìn)行播種施肥一次性作業(yè)；（2）永發(fā)鄉(xiāng)（YH）：玉米收獲后秸稈全部粉碎回田，兩年播種前深翻一次后持續(xù)免耕；（3）農(nóng)安（NH）：玉米收割后1/3秸稈粉碎還田，次年深翻；（4）公主嶺（AH）：深翻配施有機(jī)肥。各處理設(shè)置的同時均有農(nóng)民現(xiàn)行耕作對照。土壤樣品采集于2011年10月中旬，供試土壤為中上層黑土，試驗采取3點取樣法，去除土樣雜質(zhì)、細(xì)根，將鮮土保存在4℃冰箱中待測。

1.3 土壤DNA提取與PCR擴(kuò)增 采用FastDNA SPIN Kit for Soil土壤DNA提取試劑盒。按試劑盒規(guī)定的實驗步驟進(jìn)行土壤DNA的提取，所提取的DNA用試劑盒純化后保存。每個樣品3次重復(fù)，以341f，758r（生工合成）為引物，在PTC-200PCR儀（Bio-Rad，美國伯樂公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10×buffer 5μL，10mmold NTP 4μL，10pm正反引物各1μL，taqDNA聚合酶0.4μL，無菌水37.5μL，模板1μL。（大連寶生物公司）。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，65℃（-0.5℃ per cycle）退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，12個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4 樣品的DGGE分析 用擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，所用儀器為D-Code Universal Detection Mutation system （Bio-Rad，美國伯樂公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國伯樂公司）。DGGE的凝膠濃度為6%，變性梯度為30%～60%，在60℃，180V條件下電泳6h.電泳膠片用Genefinder熒光染料染色。

1.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Quantity One4.2.3軟件，采用非加權(quán)成對算術(shù)平均法（UPGMA）對所有土壤樣品進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耕作方式對農(nóng)田耕層土壤微生物多態(tài)性的影響 對耕層土壤微生物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，分別得到不同地區(qū)土壤細(xì)菌的DGGE圖譜。從圖1中能夠清晰的看出菌群的整體分布多樣性和優(yōu)勢菌的分布和數(shù)量。各樣品的細(xì)菌DGGE圖譜的條帶數(shù)、條帶位置和亮度呈現(xiàn)明顯的差異。DGGE凝膠電泳能夠分離長度相同而序列不同的DNA條帶，條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶信號越亮表示對應(yīng)該條帶的細(xì)菌數(shù)量越多，從而可反映出微生物的數(shù)量和種類[13]。不同處理間有很多共有條帶，說明處理間微生物群落結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的相似性，然而這些共有條帶粗細(xì)強(qiáng)度的差異，說明同一種微生物在不同處理內(nèi)豐度不同。不同處理間出現(xiàn)的條帶的增加或缺失現(xiàn)象，說明不同處理間微生物多樣性存在一定的差異。圖1顯示，3種處理耕作方式TH/YH/NH都較它們的傳統(tǒng)方式TS/YL/NL土樣條帶數(shù)量多，亮度強(qiáng)。其中NH/NL組條帶數(shù)目差異明顯，NH較NL條帶數(shù)量變化最多；TH較YL條帶亮度變化最強(qiáng)；TH較TS在數(shù)量及亮度上也有變化，但是變化幅度較小。表明不同耕作處理下的農(nóng)田土壤微生物多樣性較農(nóng)民常規(guī)耕作下土壤微生物多樣性豐富。

圖1 不同耕作方式下耕層土壤細(xì)菌DGGE圖譜

進(jìn)一步利用Quantity One4.2.3對DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，通過UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，得到不同耕作下土壤微生物組成的聚類分析系統(tǒng)樹。結(jié)果如圖2所示，圖2中處理分為2個族群，NL點處為一個族群，其余TH/YS、YH/TL和NH為另一個族群。說明深翻結(jié)合秸稈還田能夠改變土壤中微生物組成。說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)類型因耕作方式不同，表現(xiàn)出明顯差異。聚類分析系統(tǒng)樹顯示TH/TS、NH/NL均首先聚類，表明其土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)較為接近；YH/YL未首先聚類，說明深翻配施秸稈還田促進(jìn)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性。

圖2 不同耕作處理與傳統(tǒng)耕作耕層土壤微生物組成的聚類分析

2.2 不同耕作方式對農(nóng)田犁底層土壤微生物多態(tài)性的影響 應(yīng)用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對土壤犁底層微生物進(jìn)行DGGE電泳分析，分別得到犁底層細(xì)菌DGGE圖譜條帶，如圖3顯示。同樣，從圖3中能明顯看出，犁底層中TH/YH/NH的條帶數(shù)量及亮度方面要較TS/YL/NL等傳統(tǒng)耕作土壤中微生物數(shù)量大，亮度強(qiáng)。

圖3 不同耕作方式下犁底層土壤細(xì)菌DGGE圖譜

圖4聚類分析系統(tǒng)樹中顯示，TH/NH和TS/NL首先聚類，說明四位一體耕作方式和深翻結(jié)合1/3秸稈還田對土壤微生物種類結(jié)構(gòu)沒有影響；并且NL/TS以及NH/TH的聚類結(jié)果顯示不同樣地同一深度的犁底層土壤微生物具有較高的相似性。

圖4 不同耕作方式下犁底層土壤微生物組成的聚類分析

2.3 不同耕作方式對農(nóng)科院試驗田耕層和犁底層土壤微生物多態(tài)性的影響 通過Quantity One軟件包對農(nóng)科院試驗站的土樣進(jìn)行DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，如圖5所示，C點耕層（0～20cm）條帶數(shù)較傳統(tǒng)耕作的耕層A點（0～20cm）條帶數(shù)多且條帶明亮，D點犁底層（20～40cm）條帶數(shù)較傳統(tǒng)耕作B點犁底層（20～40cm）條帶數(shù)多且條帶較亮，說明施入的有機(jī)肥能增加土壤中微生物的種類和數(shù)量。

注：A=Al（0～20cm）；B=AL（20～40cm）；C=AH（0～20cm）；D=AH（20～40cm）。

圖5 不同耕作方式下耕層與犁底層土壤細(xì)菌DGGE圖譜

從圖6的聚類分析系統(tǒng)樹看出A、B、D三點首先聚類，而C點未能與其聚類，由此可以說明深翻配施有機(jī)肥同樣能夠促進(jìn)耕層土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性。

圖6 不同耕作方式下耕層與犁底層土壤微生物組成的聚類分析

2.4 不同耕作制度下土壤微生物香濃威爾多樣性的影響 根據(jù)土壤在DGGE圖譜上的條帶信息，計算出的Shannon-weiner多樣性指數(shù)，如表1所示。從表1中看出，4種不同耕作處理下的土壤微生物香濃指數(shù)都較農(nóng)民常規(guī)耕作下微生物香濃指數(shù)高，說明4種耕作方式都能促進(jìn)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性。這可能是由于4種耕作處理可以為土壤微生物提供相應(yīng)的養(yǎng)分和適宜的生存環(huán)境，促使各類微生物很好的生長，因而微生物多樣性指數(shù)較高。四位一體耕作方式下土壤微生物的香濃指數(shù)增幅最大，耕層和犁底層分別為23.2%和15.5%，

表1 不同耕作與常規(guī)耕作耕層土壤與

犁底層土壤香濃威爾多樣性指數(shù)

[耕作＼1＼2＼3＼4＼4種耕作＼耕作層＼2.39＼2.38＼2.36＼2.63＼＼犁底層＼2.00＼2.04＼2.25＼2.38＼常規(guī)耕作＼耕作層＼1.94＼2.30＼2.25＼2.48＼＼犁底層＼1.70＼1.92＼2.01＼2.29＼]

3 結(jié)論與討論

黑土土壤中的微生物具有數(shù)量大、種類繁多等特性，因此本實驗采用了16S rDNA擴(kuò)增的DGGE方法研究不同耕作制度下土樣微生物群落的多樣性。通過分析農(nóng)民常規(guī)耕作下農(nóng)田土壤與不同耕作處理下農(nóng)田土壤中微生物組成的DGGE圖譜，顯示了不同樣地或同一樣地不同深度土層土壤微生物組成的多態(tài)性。微生物是農(nóng)田土壤中的核心組成部分，不但能為作物提供營養(yǎng)元素和最佳的生長環(huán)境，還能保持土壤的基本生產(chǎn)力。有研究表明，腐解的秸稈扮演著養(yǎng)分和載體的角色[14]，能夠增加有機(jī)碳含量進(jìn)而改善土壤環(huán)境，顯著降低土壤pH值，增加土壤微生物數(shù)量。因此，對于促進(jìn)作物生長、改善和提高土壤質(zhì)量具有重要作用[15]，施肥可以增加根系的分泌物，給土壤微生物提供能源物質(zhì)，進(jìn)而提高土壤微生物量[16]。從DGGE圖譜中看出（圖1、圖3、圖5），耕層土壤微生物組成中TH/YH以及AH的電泳條帶都較TS/YL和AL電泳條帶數(shù)量多，亮度強(qiáng)；對犁底層來講，同樣是不同耕作措施下土壤微生物要較傳統(tǒng)耕作下土壤微生物類群豐富，種類繁多。這說明了增施有機(jī)肥或秸稈還田都能明顯增加土壤微生物類群和數(shù)量。這與施用有機(jī)肥可以維持較高的土壤微生物活性，保持微生物多樣性與生態(tài)穩(wěn)定性相一致[17]。秸稈還田可以為微生物的生長活動提供必要的能源和營養(yǎng)物質(zhì)，加快刺激土壤中微生物的活性，從而加快土壤中微生物的自身物質(zhì)合成，并利用外源養(yǎng)分進(jìn)行新陳代謝[18]；有結(jié)果表明農(nóng)民常規(guī)耕作模式下土壤微生物的DGGE條帶數(shù)明顯少于適宜的耕作模式處理，說明農(nóng)民常規(guī)耕作降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性[19]。利用Quantity One4.2.3軟件對土壤DGGE圖譜進(jìn)行的聚類分析顯示，無論是傳統(tǒng)耕作還是不同耕作制下同一地區(qū)不同深度土壤的微生物組成具有多態(tài)性。

就Shannon-Weiner指數(shù)而言，不同耕作下的土壤耕層香濃指數(shù)都較農(nóng)民常規(guī)耕作下耕層香濃指數(shù)高，這是由于秸稈還田可以直接為土壤微生物提供充足的有效養(yǎng)分，改善土壤微生物棲息環(huán)境[14]，提高了耕層土壤生態(tài)環(huán)境的緩沖能力。而犁底層可能是由于養(yǎng)分運輸?shù)南拗?，微生物不能得到充足的營養(yǎng)和適宜的生存環(huán)境，所以在類群功能和數(shù)量上不能像表層微生物那樣豐富。通過對比不同耕作措施下的微生物香濃指數(shù)，發(fā)現(xiàn)陶家子耕作方式下土壤微生物多樣性變化最高，耕層和犁底層增幅分別為23.2%和15.5%。推測其可能原因是根茬還田補(bǔ)充輸入了有機(jī)碳源又改善了土壤物理性狀，有利于維持土壤微生物的多樣性及活性[20]，另外旋耕增強(qiáng)了土壤的通氣能力，同時也使土壤的孔隙度增加，因此微生物的活動能力也相應(yīng)的增強(qiáng)。

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