甘蔗14—3—3基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及分析

摘 要：該實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建甘蔗14-3-3基因的真核表達(dá)載體，為體外研究該蛋白功能和高級(jí)構(gòu)象特征奠定基礎(chǔ)。用RT-PCR技術(shù)從甘蔗莖中擴(kuò)增出編碼14-3-3蛋白的全長(zhǎng)基因，并連入pGEM-T載體中，雙酶切和測(cè)序用于序列正確性的鑒定。結(jié)果表明，該基因的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?71bp，編碼256個(gè)氨基酸。后將所得cDNA片段亞克隆至真核表達(dá)載體pPIC9K，經(jīng)電轉(zhuǎn)后在酵母細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定分子量約為28kD。表明已成功構(gòu)建了甘蔗14-3-3蛋白真核表達(dá)載體，并獲得了表達(dá)產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：甘蔗；14-3-3基因；表達(dá)載體

中圖分類號(hào) S66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）21-17-03

14-3-3蛋白是一種酸性二聚體可溶性蛋白，是高度保守并在真核生物中普遍存在的一類調(diào)節(jié)性蛋白，可通過(guò)識(shí)別特異的磷酸化序列與靶蛋白相互作用[1]。近幾年來(lái)，有關(guān)植物14-3-3蛋白的研究己取得較大進(jìn)展（如：參與多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、各種代謝調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸和光信號(hào)應(yīng)答等調(diào)控過(guò)程），使之成為生物化學(xué)及信號(hào)途徑研究領(lǐng)域中的前沿課題[1-2]。然而，14-3-3蛋白與一些蛋白之間的相互作用機(jī)制仍不清楚。與模式植物相比，14-3-3蛋白在甘蔗等一些經(jīng)濟(jì)作物上的研究仍然很少，尤其是通過(guò)改變14-3-3蛋白活性進(jìn)而來(lái)調(diào)節(jié)和影響植物發(fā)育代謝相關(guān)的信號(hào)通路，以提高作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，尚有待進(jìn)一步研究探討。

本課題組前期克隆得到一個(gè)編碼甘蔗14-3-3的基因，發(fā)現(xiàn)其與玉米和高粱蛋白的同源性較高，并通過(guò)相關(guān)軟件和網(wǎng)站對(duì)14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測(cè)和解析，發(fā)現(xiàn)一些功能活性位點(diǎn)（已被《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》收稿）。有研究表明14-3-3蛋白調(diào)節(jié)功能的行使依賴于靶蛋白磷酸化來(lái)發(fā)揮作用[3]，不僅調(diào)控許多關(guān)鍵信號(hào)蛋白（如BZR1、RSG和CDPK1等）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且可以作用于同一信號(hào)通路上不同的信號(hào)蛋白[2]。再者，14-3-3蛋白雖然高度保守，但其N-端和C-端均具有較高的變異性，這一特征可能與14-3-3蛋白功能的差異性相關(guān)[4]。

為明確甘蔗14-3-3蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和N-端及C-端的功能，本研究通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體，用雙酶切和測(cè)序技術(shù)加以驗(yàn)證，最后使用Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)量和純度，為了解蛋白功能活性位點(diǎn)及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑 甘蔗（S.officinaram L.）莖段采自中國(guó)熱帶科學(xué)院南亞熱帶作物究所甘蔗種質(zhì)資源圃，材料立刻放于液氮中處理，并置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

一鏈合成試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天澤生物公司；膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)有限公司；pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司；其它生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 甘蔗總RNA提取和14-3-3基因擴(kuò)增 甘蔗總RNA提取使用天澤生物公司RNA提取試劑盒，具體操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNAstar、Primer 5.0和DNAman等軟件用于序列分析和引物設(shè)計(jì)。mRNA Selective PCR Kit Ver 1.1一步法（TaKaRa）對(duì)目的基因進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系為：2×mRNA 選擇性PCR緩沖液Ⅰ25μL、MgCl2 10μL、dNTP混合劑5μL、RNase抑制劑1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1μL、正反向引物各1μL（正向引物：CGGAATTCCGATGTCGAGGGAGGAGAATGTT含有EcoRI的酶切位點(diǎn)；反向引物：TTGCGGCCGCCTCCGAAGATTACTGTCCCTCG含有NotI的酶切位點(diǎn)）、約1μg總RNA、混合模板1μL、最后加入無(wú)RNase H2O至總體積50μL，擴(kuò)增程序?yàn)?0℃ 15min；85℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 2min，共38個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，-20℃保存?zhèn)溆谩７磻?yīng)結(jié)束后，取上述擴(kuò)增產(chǎn)物于含EB的1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果。回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T Vector（Promega公司）連接，轉(zhuǎn)入DH5α中，驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后呈送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 PCR產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物回收依據(jù)OMEGA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，后與pGEM-T載體在4℃條件下連接過(guò)夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑和酶切雙重手段對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。

1.4 pPIC9K-14-3-3表達(dá)載體構(gòu)建 結(jié)合引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用EcoR I和Not I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后與pPIC9K表達(dá)載體相連（圖1），10μL反應(yīng)體系為：T4 DNA連接酶1μL，反應(yīng)Buffer 1μL，載體2μL及6μL目的片段，4℃反應(yīng)過(guò)夜，混合反應(yīng)液轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取重組質(zhì)粒，用EcoR I和Not I雙酶切進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。

圖1 pPIC9K-14-3-3表達(dá)載體構(gòu)建路線

1.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化 酵母轉(zhuǎn)化依據(jù)酵母表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)進(jìn)行（Invitrogen，California，USA）。10μg含有目的片段的表達(dá)載體pPIC9K-14-3-3通過(guò)電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母中（GS115）。后在YPD選擇性平板上培養(yǎng)和篩選多拷貝的克隆。

1.6 蛋白表達(dá)及Western blot 14-3-3蛋白分離參照畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)進(jìn)行（Invitrogen，California，USA）。25mL的BMGY培養(yǎng)基用于單克隆的培養(yǎng)，在250r/min和30℃條件下培養(yǎng)至OD>2時(shí)，通過(guò)離心（3000g，5min，室溫）收集酵母細(xì)胞。用200mL BMMY液體培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞，0.5%（v/v）的甲醇30℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)72h后，收集蛋白用于Western blot分析。

蛋白樣品用12% SDS-PAGE進(jìn)行分離，后電轉(zhuǎn)移至NC膜上。使用麗春紅染色來(lái)檢測(cè)膜上蛋白的含量，并標(biāo)記不同的蛋白分子量。使用雙蒸水洗去殘留的染料。再使用封閉液封閉NC膜30min。一抗稀釋在封閉液中與NC膜溫育1h，使用TBST洗去一抗。之后加入稀釋于封閉液的二抗，溫育1h，再用TBST洗去二抗。最后使用3，3’-diamino-benzidine（DAB）顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR克隆甘蔗14-3-3全長(zhǎng)基因 根據(jù)前期研究結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖2所示，所得片段為750～1 000bp，且無(wú)雜帶污染，說(shuō)明所用引物為特異性擴(kuò)增。對(duì)目的片段回收并連入pGEM-T載體中，驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后測(cè)定基因的序列。結(jié)果表明，甘蔗14-3-3基因最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?71bp，編碼256個(gè)氨基酸，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

注：M：marker DL2000分子量標(biāo)記；1～2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 甘蔗全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增

2.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建 將上述的PCR產(chǎn)物，用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切后連入pPIC9K表達(dá)載體，為篩選陽(yáng)性克隆，本實(shí)驗(yàn)采用雙酶切的手段進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，可得到一條約700bp的條帶，與測(cè)序的基因片段大小相符，表明目的片段已連入表達(dá)載體中。

注：M：1kb分子量標(biāo)記；1：酶切產(chǎn)物。

圖3 酶切檢測(cè)電泳圖

2.3 蛋白分離及檢測(cè) 將14-3-3基因連入表達(dá)載體pPIC9K，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母GS115基因組中。因14-3-3蛋白的N端連有畢赤酵母α因子信號(hào)肽，所以14-3-3蛋白可分泌到胞外。0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h之后，收集培養(yǎng)基上清蛋白并濃縮后用SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)，圖3結(jié)果證實(shí)14-3-3基因在畢赤酵母細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖4 蛋白分離及Western blot結(jié)果

3 討論

研究表明，14-3-3蛋白具有蛋白結(jié)合能力及多樣化的功能，在各種不同細(xì)胞功能和生理過(guò)程中起調(diào)控作用[1-3]，可能是細(xì)胞內(nèi)處理蛋白間相互作用的核心蛋白，但是這主要集中于模式植物擬南芥中，在其它植物中是否也是這樣還不清楚[5]。迄今為止，研究得最多的是14-3-3蛋白與其直接靶蛋白的關(guān)系，而其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游、下游成分間的協(xié)同調(diào)控研究較少，尚未建立起一種植物的14-3-3蛋白信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2]。14-3-3蛋白是真核生物體內(nèi)普遍存在的多基因編碼蛋白質(zhì)家族，既具有多種同源或異源異構(gòu)體，然而，哪些14-3-3蛋白參與表達(dá)調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。

由于植物體代謝的復(fù)雜性，給相關(guān)基因蛋白功能的研究帶來(lái)了困難。真核生物基因體外表達(dá)手段為蛋白功能研究提供了可能，酵母作為受體是當(dāng)前使用的手段之一。在本研究中發(fā)現(xiàn)pPIC9K-14-3-3在畢赤酵母中的表達(dá)量較低，推測(cè)其原因可能有以下幾種：首先，酵母對(duì)氨基酸密碼子的偏好性，可能限制其蛋白質(zhì)翻譯速度[6]。無(wú)論大腸桿菌還是酵母，高表達(dá)的蛋白基因中低頻密碼子則明顯減少，因?yàn)榈皖l密碼子含量高的蛋白質(zhì)大量表達(dá)都對(duì)自身具有毒害作用[7]。Zhang等將低頻密碼子AGG突變?yōu)橥吹腃GA，編碼天冬氨酸的GAT突變?yōu)榫幋a谷氨酸的GAA，并引入了酵母偏好的TCC，最終實(shí)現(xiàn)了HIV-1 GP120在畢赤酵母中高量表達(dá)[8]；其次，重組質(zhì)粒拷貝數(shù)增多后，可能在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生后生的調(diào)節(jié)，影響重組蛋白產(chǎn)率的提高。除此之外，外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)不僅受到基因劑量、整合位點(diǎn)、mRNA5’和3’非編碼區(qū)、cDNA的AT含量、翻譯起始區(qū)和信號(hào)肽等的影響，還受到后期蛋白加工及培養(yǎng)基的影響[9]。通常提高氧飽和度可以提高蛋白表達(dá)量[10]，但有時(shí)表達(dá)量的差異并不能完全用氧飽和度來(lái)解釋。另外，有些蛋白在畢赤酵母中分泌表達(dá)時(shí)會(huì)發(fā)生過(guò)度糖基化，過(guò)度糖基化也會(huì)帶來(lái)類似的問(wèn)題[11]，因此，本研究的蛋白表達(dá)體系還有待進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)上述的原因加以改進(jìn)，為甘蔗14-3-3蛋白的功能研究提供基礎(chǔ)。

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