高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中的4種雌激素

摘要：采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中的4種雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）。檢測(cè)條件為色譜柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果表明，4種雌激素成分在0.02～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系。樣品平均加標(biāo)回收率為92.4%～109.3%，RSD為2.4%～3.4%，飼料中4種雌激素的檢出限為0.010～0.030 mg/kg。該法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，可同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物飼料中4種雌激素含量。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；雌激素；動(dòng)物飼料

中圖分類號(hào)：O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）12-2907-02

Determination of Four Estrogens in Animal Feeds by HPLC

YU Xiao1，ZHAI Hai-yun1，LIN Hai-dan2，ZHAO Chun-hua1，LU Qi-wen1，PAN Yu-fang1

（1. Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006，China；

2. Guangdong Institute of Veterinary Drug and Feedstuffs Control， Guangzhou 510230，China）

Abstract： The simultaneous determination method of four estrogen （estrone， estriol， ethiny， diethylstilbestrol） in animal feeds were established by RP-HPLC with Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm） column at 25 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water （60∶40，V/V）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 279 nm. The results revealed that there were good linear responses in the range of 0.02～200 μg/mL of 4 estrogens， and LODs were 0.010～0.030 mg/kg. The average recoveries were 92.4%～109.3% with RSD of 2.4%～3.4%. Consequently， the method was simple， sensitive for quality control of these estrogens in animal feeds.

Key words： HPLC； estrogen； animal feeds

飼料安全是動(dòng)物性食品安全的重要環(huán)節(jié)，近年來(lái)，由飼料安全問(wèn)題引發(fā)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生。在飼料和動(dòng)物飲用水中非法添加的雌激素能促進(jìn)機(jī)體的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。雌激素在動(dòng)物體內(nèi)一般難以降解，人食用后可在人體內(nèi)（主要是內(nèi)臟、血液中）積累，擾亂內(nèi)源雌激素的正常作用，誘發(fā)癌癥、早熟、女性男性化和男性女性化等癥狀，其毒性還可通過(guò)母體胎盤和母乳傳給后代，對(duì)人類健康危害極大[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)文件明確禁止在動(dòng)物飼料和飲用水中添加雌激素。目前激素分析技術(shù)主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2]、高效液相色譜法[3，4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5，6]等。本試驗(yàn)建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中4種雌激素（雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚）的方法，該方法將為動(dòng)物飼料中上述4種雌激素的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售雞、豬、蝦、魚配合飼料。

1.2 試劑與儀器

色譜純甲醇，購(gòu)于Dima公司；去離子水；其余試劑均為分析純。雌三醇對(duì)照品（批號(hào)100935-200701）、炔雌醇對(duì)照品（批號(hào)100052-200308）、雌酮對(duì)照品（批號(hào)100849-200501）、己烯雌酚對(duì)照品（批號(hào)100033-200607）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

高效液相色譜儀（LC-10ATvp型輸液泵，SCL-10Avp型控制器，二極管陣列檢測(cè)器，LC Solution色譜工作站，日本島津）、超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、離心機(jī)（鞏義市予華儀器有限公司）、數(shù)控恒溫水浴鍋（北京康林科技有限責(zé)任公司）、電子分析天平、0.45 μm微孔濾膜及配套注射器。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：279 nm，進(jìn)樣量：20 μL。樣品測(cè)定采用色譜峰的保留時(shí)間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，外標(biāo)法峰面積定量。

1.3.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備 分別稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚對(duì)照品各1 mg，用甲醇溶解并定容至1 mL，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液到5 mL容量瓶中，用甲醇定容，配成濃度為0.02～200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取飼料樣品1.000 g于10 mL離心管中，加入9 mL甲醇，超聲波處理60 min，離心，移取上層清液至另一支10 mL離心管，氮?dú)獯蹈?；加? mL甲醇，超聲波溶解5 min后轉(zhuǎn)至5 mL離心管，并用1 mL甲醇洗滌原離心管，合并于5 mL離心管中，氮?dú)獯蹈?；? mL甲醇超聲波溶解殘?jiān)? min，溶液經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

在上述色譜條件下4種對(duì)照品的色譜圖見圖1。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系及檢出限 在設(shè)定色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為0.02～200 μg/mL，分別取20 μL進(jìn)行HPLC分析。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明4種雌激素均在0.02～200 μg/mL范圍內(nèi)波度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，各標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和檢出限（s/n=3）如表1所示。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 用濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定4種雌激素的峰面積，并計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.3%。

2.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取不同種類的不含雌激素的飼料樣品1.000 g，平行6份，分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后按照“1.3.2”制備供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均加標(biāo)回收率分別為92.4%～99.3%、102.8%～109.3%、90.5%～95.7%和100.6%～107.8%，平均RSD分別為3.0%、2.7%、2.4和3.4%。

2.3 樣品分析

按本方法對(duì)市售動(dòng)物飼料樣品進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖2。以保留時(shí)間和檢出峰的光譜圖定性分析，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，雞、豬、蝦和魚配合飼料中均檢出含有雌三醇，含量分別為1.11、1.87、0.919和3.13 mg/kg，但未檢出雌酮、炔雌醇和己烯雌酚。另外，從圖2可見，樣品經(jīng)前處理后，各飼料基質(zhì)對(duì)雌激素的檢出無(wú)干擾。

3 小結(jié)

在預(yù)試驗(yàn)中比較了不同配比甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相體系對(duì)各雌激素分離以及飼料基質(zhì)干擾的影響，結(jié)果表明，在60∶40體積比的甲醇-水流動(dòng)相條件下，4種雌激素分離良好，飼料中基質(zhì)成分不干擾測(cè)定。采用二極管陣列紫外檢測(cè)器對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，可通過(guò)保留時(shí)間和檢出峰的光譜圖進(jìn)行雌激素的定性分析，避免了普通紫外檢測(cè)器的假陽(yáng)性結(jié)果。由于本試驗(yàn)所用的幾種動(dòng)物飼料中均檢出雌三醇，故提示相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)食用動(dòng)物飼料中相關(guān)雌激素的管理和監(jiān)督。

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