核糖體工程改造海綿共附生放線菌紫色素的特性

摘要：從西沙海域未鑒定海綿樣品中分離到一株命名為SCKA-96.5的放線菌菌株，該菌在海水高氏I號培養(yǎng)基上產生灰白色氣生菌絲。16 S rDNA序列分析表明，該菌為鏈霉菌屬放線菌。通過核糖體工程技術獲得其變異菌株SCKA-96.5K，該變異株在海水高氏I號培養(yǎng)基上能穩(wěn)定地產生可溶性紫色素。對SCKA-96.5K所產的紫色素進行粗提取及穩(wěn)定性分析，了解相關理化因素對其穩(wěn)定性的影響。初步研究結果表明，在波長600 nm處該紫色素具有最大吸光度；熱穩(wěn)定性較好；顏色隨pH的變化明顯；強氧化劑次氯酸鈉對其破壞較大，在弱還原劑中比較穩(wěn)定；葡萄糖等食品添加劑對其基本沒有影響。作為一種潛在的天然色素資源，該紫色素具有一定的工業(yè)開發(fā)價值。

關鍵詞：海綿共附生放線菌；核糖體工程；紫色素；穩(wěn)定性

中圖分類號：Q939.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2900-07

Characterization of Purple Pigment Produced by Sponge Associated Actinomycete Strain Transformed by Ribosome Engineering

ZHOU Dan-yan1，2，WANG Guang-hua1，DAI Shi-kun1，CHEN Wen1，2，LI Xiang1

（1.Key Laboratory of Marine Bio-Resources Sustainable Utilization，Key Laboratory of Marine Drug / South China Sea Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China；2.Graduate University，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract： An actinomycete strain SCKA-96.5 was isolated from an unidentified sponge sample from Xisha sea. The strain produced grayish-white aerial mycelium on Guase’s No. I medium supplemented with seawater. The 16 S rRNA gene sequence of strain SCKA-96.5 showed that it was assigned to Streptomyces. Its mutant strain， SCKA-96.5K， obtained by ribosome engineering， was able to produce a purple diffusible pigment stably. The pigment was extracted； and its physicochemical properties were analyzed. The results showed that the maximum absorption wavelength was 600 nm； the pigment was stable to heat and food additives； its color changed significantly when pH changed； strong oxidant NaClO could destroy the pigment while weak reductants didn’t had any effect on the pigment. The purple pigment had the potential to be developed for future application as a kind of natural pigment.

Key words： sponge associated actinomycete； ribosome engineering； purple pigment； stability

與人工色素相比，天然色素大多無毒、安全性高、色澤柔和鮮艷，更加切合現(xiàn)代人“崇尚自然，追求健康”的理念，因此在食品、印染、化妝品等行業(yè)中應用日益廣泛。天然色素主要來自于動植物及微生物，其中對植物源天然色素（如花青素類、類胡蘿卜素類、黃酮類化合物）的研究居多，如紫色素主要從甘薯[1]、葡萄皮[2]、紅心蘿卜[3]、茄子[4]、紫心玉米[5]、紅藍草[6]等植物中提取獲得。微生物也是一種良好的天然色素源。少數(shù)放線菌特別是鏈霉菌能產生天然色素，如從鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）菌絲體分離得到的放線菌紫紅素（Actinorhodin）屬于同色烷醌類抗生素，其性質等各方面已有相關研究報道[7-12]；Lu等[13]從土壤中分離到一株鏈霉菌，該菌產生的色素與放線菌紫紅素（Actinorhodin）性質相似；Zhang等[14]從S. coelicolor發(fā)酵產物中獲得了藍色色素λ-actinorhodin，該化合物是一種放線菌素新類似物；王麗等[15]從土壤樣品中篩選到一株紫色素高產放線菌；Dastager等[16]從土壤鏈霉菌代謝產物中分離到黑色素（Melanin）。一些海洋微生物能產生色素，已有一些學者對海洋微生物所產色素做了研究，如Yada等[17]從日本太平洋海岸320 m深海水樣品中分離得到13株產紫色素的Pseudoalteromonas屬的海洋細菌，通過質譜和核磁共振技術證明這些菌株產生的紫色素為紫色桿菌素；Elbandy等[18]首次從海綿共附生淡紫擬青霉菌（Paecilomyces lilacinus）中獲得黃色素（Cyclohexenones）；Grossart等[19]從海洋細菌Rheinheimera spp.獲得了藍色素（Glaukothalin），該色素顯示了較強的抗Artemia salina活性；Vasanthabharathi等[20]研究了海洋鏈霉菌發(fā)酵產黑色素的條件，并獲得了具有較強抗菌活性的黑色素；曾春民等[21]從大亞灣分離到細菌Pseudomonas sp.，該菌能產生化合物靈菌紅素，該色素可作為天然色素或抗菌素來開發(fā)；李厚金等[22]篩選到產紅色素海洋細菌Pseudomonas sp.；溫露等[23]篩選到產抗腫瘤藍色素的海洋細菌Pseudomonas sp.；侯竹美等[24]從膠州灣海域中篩選到一株產藍色素的海洋鏈霉菌Streptomyces sp.，研究發(fā)現(xiàn)其對綠膿桿菌、隱球菌有較強的抑菌活性；孫愛飛等[25]從海泥中分離到了一株海洋細菌，它具有穩(wěn)定產生藍紫色素的特性；李雪萍[26]從海洋羽毛山海綿Mycale plumose中篩選到產十一烷基靈菌紅素的海洋放線菌糖多孢菌Saccharopolyspora sp.，并對其進行了提取及抗腫瘤性的研究；劉彬等[27]對分離自南極海洋的寡營養(yǎng)細菌產生的褐色素進行了研究；李鵬等[28]從舟山群島潮間帶海域篩選到產黑褐色色素的Streptomyces sp.。

紫色素是一種罕見的天然色素，具有一定的活性。例如柳珊瑚蟲排泄管骨片中增加的紫色素對自身抵抗疾病、保護機體方面具有積極作用[29]；紫A4甘薯色素具有明顯的自由基清除能力[1]，可作為保健食品中的功能性有效成分[30]；主要來源于Chromobacterium sp.和Janthinobacterium sp.的紫色素——紫色桿菌素具有抗蟲、抗腫瘤活性[31-37]；Steinerová等[38]從鏈霉菌Streptomyces aureofaciens的代謝產物中獲得了紫色素（Purpurin）及其衍生物，并證明所獲物質在100 μg/mL濃度下均具有免疫活性且對試驗對象無毒性；Nishimura等[39]的研究表明，紫色素可以作為特異的與腫瘤密切相關的血漿透明質酸結合蛋白的蛋白酶活性抑制劑。然而，目前國內外對產紫色素的海綿共附生放線菌的文獻報道還較少。因此，本研究對從海綿中分離到的一株放線菌菌株SCKA-96.5進行核糖體工程改造，獲得穩(wěn)定產紫色素的抗性突變株SCKA-96.5K，并對SCKA-96.5K的色素性質進行了研究，以期為天然色素的開發(fā)打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 對SCKA（Starch casein KNO3 agar）基礎培養(yǎng)基進行10倍稀釋，分離菌株；種子培養(yǎng)基為AM2-like培養(yǎng)基，產色素培養(yǎng)基為海水配制的高氏I號培養(yǎng)基。SCKA培養(yǎng)基配方：淀粉20 g，KNO3 2 g，K2HPO4 2 g，酪蛋白0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂17 g，用天然海水定容至1 L。AM2-like培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g，可溶性淀粉5 g，黃豆粉10 g，蛋白胨2 g，酵母提取物2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，碳酸鈣2 g，用天然海水定容至 1 L，pH 7.0～7.4。

1.1.2 抗菌活性測試菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis），大腸桿菌（Escherichia coli）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的核糖體工程改造

1）原始菌株。采集西沙海域的海綿樣品，制成勻漿，于SCKA 10倍稀釋液體培養(yǎng)基（96孔板）中培養(yǎng)，培養(yǎng)3周，將培養(yǎng)液涂布于海水高氏I號培養(yǎng)基上，挑取長出的單菌落純化，獲得菌株SCKA-96.5，用20%甘油保存。

2）抗性突變株的獲得。將原始分離菌株SCKA-96.5的孢子懸液適當稀釋后涂布于含不同濃度卡那霉素的海水高氏I號平板上，于28 ℃培養(yǎng)7 d，肉眼觀察菌株生長情況，未生長菌落的卡那霉素最低作用濃度即為卡那霉素對SCKA-96.5的最小抑制濃度（MIC）。從含1 μg/mL卡那霉素平板上挑取一個形態(tài)明顯改變的單菌落純化培養(yǎng)，獲得抗性突變株SCKA-96.5K。

1.2.2 菌株的分子鑒定 菌株DNA的提取方法參照文獻[41]，16 S rDNA的PCR擴增參照文獻[39]。PCR產物測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫中應用Blast程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）與數(shù)據(jù)庫中已有細菌的16 S rDNA序列進行相似性比較。

1.2.3 產紫色素的搖瓶發(fā)酵

1）發(fā)酵方法。從海水高氏I號平板上挑取SCKA-96.5K孢子到AM2-like培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床培養(yǎng)72 h，以3%的接種量接入海水高氏I號液體培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床培養(yǎng)至發(fā)酵液呈現(xiàn)明麗鮮亮的紫紅色。

2）不同培養(yǎng)基的菌株生長及色素產生情況。在海水高氏I號培養(yǎng)基的基礎上，采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、甘油、檸檬酸鈉、可溶性淀粉、肌醇作為不同的碳源，按20 g/L的量配制培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵，觀察菌株生長及色素產生情況。在海水高氏I號培養(yǎng)基的基礎上，采用硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨作為不同的氮源，按1 g/L的量配制培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵，觀察菌株生長及色素產生情況。在海水高氏I號培養(yǎng)基的基礎上，分別采用100.0%、50.0%、25.0%、12.5%的海水（比如配制培養(yǎng)基用水為1 L，100%是指用1 L海水配制，50%是指用500 mL海水、500 mL淡水配制，25%是指用250 mL海水、750 mL淡水配制，12.5%是指用125 mL海水、875 mL淡水配制）配制培養(yǎng)基，并依次命名為1/1、1/2、1/4、1/8海水高氏I號培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵，觀察菌株生長及色素產生情況。以海水高氏I號培養(yǎng)基為對照，按不同的NaCl濃度（0、0.5、1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、150.0 g/L）配制淡水高氏I號培養(yǎng)基，觀察菌株生長及色素產生情況。

3）紫色素胞外分泌鑒定。采用常規(guī)檢測[34]進行判斷。取菌體發(fā)酵液，以6 000 r/min離心15 min，得上清液和下層菌體，觀察上清液及菌體顏色，再將所得菌體加少量去離子水，用超聲波細胞破碎10 min，以6 000 r/min離心15 min，觀察上清液顏色。

1.2.4 紫色素的提取

1）色素提取試劑的選擇。取1個培養(yǎng)基呈紫色的接菌的海水高氏I號平板，用無菌刀片平均分成8份，分別加入10 mL的水、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亞砜，過夜浸提，次日吸出溶劑，觀察溶劑及菌體瓊脂塊的顏色，并測定浸提后各溶劑在600 nm處的吸光度。

2）發(fā)酵液紫色素的提取。發(fā)酵液紫色素的提取借鑒文獻[17]、[27]、[42]的方法，并略加改進，方法如下：取菌體發(fā)酵液，以6 000 r/min離心15 min，向上清液緩慢加入無水乙醇并不斷輕搖使兩溶液充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀物質時停加無水乙醇，避光靜置，于室溫下浸提12 h；以8 000 r/min離心10 min，得色素醇提液；往色素醇提液中緩慢加入1 mol/L NaOH溶液直到溶液不再變色，避光靜置過夜；以8 000 r/min離心10 min，得藍紫色沉淀；用1 mol/L HCl溶液溶解藍紫色沉淀，加入無水乙醇二次浸提；以8 000 r/min離心10 min，得顏色更加明麗的色素醇提液；往色素醇提液中緩慢加入1 mol/L NaOH溶液直到溶液不再變色，避光靜置；以8 000 r/min離心10 min，得紫色黏稠沉淀，于100 ℃烘干（輔以無菌濾紙吸收水分）即為色素粗品。此次試驗菌株經液體發(fā)酵后色素粗提物產量達17.4 g/L。

3）瓊脂平板紫色素的無水乙醇提取。在海水高氏I號平板上劃線接種SCKA-96.5K，于28 ℃恒溫培養(yǎng)至整個瓊脂平板呈現(xiàn)紫色。用無菌竹簽將帶菌的瓊脂培養(yǎng)基挑取至盛有無水乙醇的燒杯中，靜置浸提24 h，當瓊脂塊顏色退去后丟棄瓊脂塊，以6 000 r/min離心15 min，得紫色素醇溶液[25]。

1.2.5 紫色素性質的初步研究

1）紫色素最大吸收波長的確定。以未接種菌株的液體培養(yǎng)基為空白對照，用NanoDrop紫外可見分光光度計于200～800 nm波長范圍內對色素醇溶液進行光譜掃描，確定色素最大吸收波長。

2）溫度對紫色素穩(wěn)定性的影響。將色素醇溶液分別在40、60、80 ℃水浴鍋中恒溫0.5、1.0、2.0 h，冷卻后測定吸光度。

3）pH對紫色素穩(wěn)定性的影響。取1 mL色素醇溶液，用1 mol/L HCl溶液、1 mol/L NaOH溶液分別調至pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，觀察色素的顏色變化，并于室溫下放置1 h后測定其吸光度。

4）氧化劑和還原劑對紫色素穩(wěn)定性的影響。取2.5 mL色素醇溶液，分別加入100 g/L次氯酸鈉、抗壞血酸、硫代硫酸鈉溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用去離子水補足至5 mL，混合后靜置2 h，測定各體系在600 nm處的吸光度。以2.5 mL色素醇溶液加2.5 mL去離子水為對照。

5）食品添加劑對紫色素穩(wěn)定性的影響。取2.5 mL色素醇溶液，分別加入2.5 mL 0.1、0.01、0.001 mol/L的葡萄糖、蔗糖、食鹽、檸檬酸溶液，室溫下放置12 h，測定其在600 nm處的吸光度。以2.5 mL色素醇溶液加2.5 mL去離子水為對照。

2 結果與分析

2.1 菌株SCKA-96.5的培養(yǎng)特征和分子鑒定結果

菌株SCKA-96.5在淡水、海水高氏I號平板上于28 ℃培養(yǎng)7 d，產生大量灰白色的氣生菌絲，在菌株純化過程中發(fā)現(xiàn)，SCKA-96.5在海水高氏I號平板上偶爾能夠產生紫紅色的可溶性色素，產色素能力不穩(wěn)定。將菌株SCKA-96.5的16 S rDNA序列與Genbank中已存在的細菌16 S rDNA序列進行同源性比較，結果表明，菌株SCKA-96.5與海洋鏈霉菌Streptomyces sp. SCSIO 1666（來源于南海北部沉積巖）的16 S rDNA序列有100%的相似性。

2.2 核糖體工程突變株SCKA-96.5K的培養(yǎng)特征

利用不同濃度的卡那霉素對原始菌株SCKA-96.5進行抗性篩選，得到一株在菌體色澤以及滲透到培養(yǎng)基中的產物顏色等外觀特征上與原始菌有較大差異的突變株SCKA-96.5K（圖1B）。對突變株SCKA-96.5K進行反復傳代，發(fā)現(xiàn)多次傳代后其在海水高氏I號平板上仍具有穩(wěn)定的產紫色素的特性（圖2）。因此，以SCKA-96.5K為對象初步研究其產生的紫色素的性質。

2.3 不同液體培養(yǎng)基的菌株生長及色素產生情況

不同培養(yǎng)基中菌株生長及色素產生情況見表1。取紫色系列的發(fā)酵液，以6 000 r/min離心15 min，收集上清液。結果表明，SCKA-96.5K的1/1、1/8海水高氏I號培養(yǎng)基的上清液色澤最為鮮艷明麗，但菌株在1/8海水高氏I號培養(yǎng)基中發(fā)酵周期長，在相同發(fā)酵周期內，1/8海水高氏I號培養(yǎng)基的紫色深度不及1/1海水高氏I號培養(yǎng)基。海水高氏I號培養(yǎng)基的主要成分是可溶性淀粉和無機鹽，原材料來源廣，價格低廉，故選擇海水高氏I號培養(yǎng)基作為本試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基。菌株在海水高氏I號培養(yǎng)基中發(fā)酵時形成菌球，菌球數(shù)目少，直徑小，搖床培養(yǎng)8 d后發(fā)酵液才逐漸顯現(xiàn)紫色。

2.4 細胞色素胞外分泌鑒定分析

將菌株發(fā)酵液離心后可以觀察到上清液為深紫色；下層菌體超聲波破碎離心后發(fā)現(xiàn)上清液無色。由此可判定該色素屬于胞外分泌產物。

2.5 色素提取試劑的選擇結果

天然色素原料萃取所用的溶劑應根據(jù)不同原料所含色素的性質來選擇，一般采用的試劑是乙醇、水、丙酮、氯仿、石油醚等。SCKA-96.5K在固體、液體海水高氏I號培養(yǎng)基中都能產生紫色素，且產生的紫色素又屬于胞外分泌產物，在固體平板上培養(yǎng)時色素滲透到培養(yǎng)基中，采用有機溶劑對瓊脂塊進行浸提來確定提取SCKA-96.5K所產色素所用試劑既方便快捷又直觀。

由表2可知，甲醇、乙醇、異丙醇和二甲基亞砜的提取效果較好，但甲醇、異丙醇和二甲基亞砜的毒性都比乙醇高，另外，考慮經濟成本，選擇乙醇作為本試驗紫色素的提取試劑。色素粗提物在各種溶劑中的溶解性試驗結果（表3）與溶劑提取結果一致，表明這種選擇提取試劑的方法是可行的。圖3為利用乙醇提取到的色素粗提物。

2.6 紫色素性質的初步研究

2.6.1 紫色素的吸收光譜 由圖4可知，發(fā)酵液上清、色素醇提液（均為明亮的紫色）在可見光區(qū)600 nm處有吸收峰，在紫外光區(qū)也出現(xiàn)一些吸收峰，可能是因為提取液中含有蛋白質、核酸或某些攜帶醛基、酮基的化合物，這些化合物在紫外光區(qū)均有吸收。為避免其他因素的干擾，更準確地反映紫色素的相對含量，選取600 nm作為本研究中確定天然紫色素相對含量的吸收波長。

2.6.2 溫度對紫色素穩(wěn)定性的影響 色素溶液的熱穩(wěn)定性結果見表4，在40～80 ℃溫度范圍內加熱色素溶液，對溶液有一定的增色作用，可能是加熱使乙醇蒸發(fā)而導致色素溶液濃度提高。可見，SCKA-96.5K代謝過程中產生的紫色素在無水乙醇中具有較好的熱穩(wěn)定性，80 ℃對該色素幾乎無影響，其色調仍保持明亮的紫色。

2.6.3 pH對紫色素穩(wěn)定性的影響 測得紫色醇溶液pH約為6。由表5可知，pH 2～5對色素的影響很大，在這個范圍內色素溶液的紫色完全退去而呈現(xiàn)淡黃色，此時溶液的吸光度極低，可能是因為該黃色溶液在600 nm處無吸收。在堿性條件下，當pH小于11時，吸光度隨著pH的增大而增大，侯竹美等[24]研究的藍色素最大吸收波長為590 nm，與本試驗采用的600 nm接近，堿性條件下色素吸光度大幅增加可能與此有關。反復調節(jié)溶液的酸堿度，顏色的變化始終保持一致，色素溶液顏色隨著pH的變化而變化的這種性質可能有助于將其開發(fā)為一種天然酸堿指示劑。

2.6.4 氧化劑和還原劑對紫色素穩(wěn)定性的影響 添加強氧化劑次氯酸鈉后，色素溶液立即變渾濁，失去原有的紫色，加1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH，溶液的紫色沒有恢復。說明在強氧化劑存在下色素被氧化，發(fā)色基團被破壞。添加抗壞血酸溶液后，溶液由紫色變?yōu)闇\黃色，加1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH，靜置片刻后溶液呈現(xiàn)褐色而不是恢復紫色。說明紫色素在強還原劑中遭到了破壞。添加硫代硫酸鈉溶液時，色調保持較好，與對照差別不大，無沉淀或渾濁，吸光度變化很小，說明該色素的穩(wěn)定性基本不受弱還原劑硫代硫酸鈉的影響。

2.6.5 食品添加劑對紫色素穩(wěn)定性的影響 由表6可知，食品添加劑食鹽、葡萄糖、蔗糖對色素溶液的影響不明顯，并且不受濃度的影響。低濃度的檸檬酸對色素有增色效應，隨著檸檬酸濃度的增加，相應的吸光度與對照差異不大。說明色素在試驗所用食品添加劑中比較穩(wěn)定。

3 小結與討論

近年來對微生物來源的天然色素的研究日趨活躍，卻鮮有對海綿來源的放線菌天然色素的研究報道。核糖體工程技術是使用能夠作用于核糖體或RNA聚合酶的抗生素（如鏈霉素、利福平、慶大霉素、卡那霉素等）對微生物進行抗性篩選，進而獲得出發(fā)菌株的抗性突變株的微生物菌種改良手段[43]。已有報道表明通過該技術可以提高或刺激微生物次級代謝產物的表達，如Hesketh等[44]通過篩選天藍色鏈霉菌對鏈霉素的抗性突變株，得到了放線紫紅素產量為野生型5倍和10倍的突變株。

在利用核糖體工程抗生素抗性篩選技術開展菌株SCKA-96.5次級代謝功能改造相關試驗的過程中，研究發(fā)現(xiàn)了一株形態(tài)與原始菌存在明顯差異且在海水高氏I號平板上能穩(wěn)定產生紫色素的突變株SCKA-96.5K。鑒于紫色素已報道的價值，試驗對SCKA-96.5K所產色素進行了初步研究，該菌株經液體發(fā)酵后色素粗提物產量達17.4 g/L，是一個紫色素高產菌株，具有較高的研究價值，為天然放線菌色素資源的開發(fā)利用打下了基礎。菌株SCKA-96.5K所產色素為胞外色素，所得色素醇溶液、色素粗提物常溫避光放置數(shù)周，色素顏色未見明顯變化，仍呈現(xiàn)鮮艷的紫色。80 ℃對色素醇溶液的穩(wěn)定性幾乎沒有影響。色素醇溶液在pH 6～9的范圍內具有穩(wěn)定性，溶液顏色隨pH變化而變化的特性使其具有開發(fā)成天然酸堿指示劑的潛力。

然而，本研究僅獲得該紫色素的一部分基本性質，尚未對其做一些必要的毒理試驗，要充分開發(fā)利用菌株SCKA-96.5K的色素資源仍需進行相關試驗。

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