纖維素酶輔助提取紫蘇中迷迭香酸工藝優(yōu)化

摘要：為了拓寬迷迭香酸的提取方法，對纖維素酶輔助提取紫蘇（Perilla frutescens）中迷迭香酸的工藝進行了相關研究。優(yōu)化了纖維素酶添加量、提取液的pH、提取溫度、提取時間及NaCl濃度等提取條件。最終確定最佳提取條件為，在不加NaCl的條件下，纖維素酶添加量為2.0%、提取液的pH 4.0、提取溫度為50 ℃、提取時間為15 min。該方法具有條件溫和、產(chǎn)物的提取率高、安全無毒害等優(yōu)點。

關鍵詞：迷迭香酸；纖維素酶輔助提??；紫蘇（Perilla frutescens）

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2888-03

Optimization of Cellulase-Assisted Extraction Technology of Rosmarinic Acid from Perilla

DONG Yan-lia，LIU Qi-fenga，ZHAO Chaob，TIAN Lu-yanga，ZHANG Li-honga，MA Jing-juna

（a.College of Science；b.College of Animal Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071001， Hebei， China）

Abstract： In order to broaden the extraction methods of rosmarinic acid， study on cellulase-assisted extraction of rosmarinic acid from perilla（Perilla frutescens） was carried out. The conditions including dose of cellulase， pH of the extractant， extraction temperature， extraction time， ionic strength， etc. were optimized. The optimum extraction conditions were ultimately determined as follows， the dose of cellulase at 2%， extractant pH 4.0， extraction temperature at 50 ℃， extraction time for 15 min. This method had the advantages of mild conditions， high extraction yield of the product， safety and no toxicity.

Key words： rosmarinic acid； cellulase-assisted extraction； perilla（Perilla frutescens）

迷迭香酸（Rosmarinic acid，簡稱RosA）是一種具有生理活性的多功能酚酸類化合物[1]，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科和傘形科等植物中[2]。研究表明，迷迭香酸具有抗氧化[3]、消炎[4]、抗血栓和抗血小板凝集[5]、抗電離輻射[6]和保護神經(jīng)元細胞[7]等作用。作為抗氧化劑，其抗氧化性強于咖啡酸、綠原酸、葉酸等，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥[8，9]等方面。紫蘇（Perilla frutescens）別名赤蘇、紅蘇、紅紫蘇等，屬桃金娘科蒲桃屬[10]。在中醫(yī)藥學中紫蘇常被用來治療抑郁癥、哮喘、感冒、焦慮、腫瘤、咳嗽、細菌感染和腸胃不適等癥[11]。目前從紫蘇中已分離出黃酮、迷迭香酸、紫蘇酮等多種活性成分，其中迷迭香酸、黃酮是紫蘇抗氧化的主要活性成分[12]。傳統(tǒng)的迷迭香酸提取方法有熱水浸提法和乙醇熱回流提取法，常常在加熱過程中導致某些藥理活性成分發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而失活[13]。纖維素酶是一類復合酶，它能將組成細胞壁的纖維素骨架逐級降解成葡萄糖，進而破壞細胞壁骨架結(jié)構(gòu)，增加細胞內(nèi)活性成分的溶出[14]。纖維素酶輔助提取法借助纖維素酶對植物細胞壁的分解作用，促進迷迭香酸從植物細胞內(nèi)快速釋放，具有反應條件溫和、產(chǎn)物得率高、安全無毒害等優(yōu)勢，目前已經(jīng)在中藥藥效成分提取中廣為應用，并取得了良好的效果[15-17]。試驗采用纖維素酶輔助提取紫蘇中的迷迭香酸，并對影響因素進行研究，拓寬了迷迭香酸的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇葉采自河北省安國市農(nóng)戶，纖維素酶（飼料級）購自晨宏飼料公司，756P型紫外可見分光光度計購自上海光譜儀器有限公司，HH·SY11-Ni2型電熱恒溫水浴鍋購自天津市中環(huán)實驗電爐有限公司，RE-85C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海青浦滬西儀器廠，pHS-3C型酸度計購自上海虹益儀器儀表有限公司，PH070A型干燥箱購自上海一恒科技儀器有限公司，SHB-3型循環(huán)水多用真空泵購自鄭州杜甫儀器廠，無水乙醇（分析純）購自北京威特化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 將新鮮紫蘇葉烘干粉碎，過40目篩，稱取1.0 g粉末樣品，置于具塞錐形瓶內(nèi)，加入一定量的纖維素酶，加入50%的乙醇溶液30 mL，調(diào)節(jié)pH至一定的值，于一定溫度下提取一定時間。提取完成后在90 ℃水浴中滅活10 min，減壓抽濾，吹干乙醇，定容至50 mL。

1.2.2 迷迭香酸得率的計算方法 提取液采用FeSO4比色法[5]，在572 nm處測得吸光度A，利用標準曲線法（A=εCL）計算迷迭香酸得率，具體計算公式如下：迷迭香酸得率=A/（ε×L）×（V測/1 000）×M×（V總/V測）×（1/m）×100%，其中，L為比色皿厚度（1 cm）；M為迷迭香酸的摩爾質(zhì)量（360.0 g/mol）；C為樣品濃度（mol/L）；ε為摩爾消光系數(shù)（3.82×103 L/mol·cm）；V總為萃取液總體積（L）；V測為待測樣品體積（1.00 mL）；m為紫蘇葉粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用Excel和Origin軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量的影響

酶是影響萃取效率的一個重要因素。由圖1可知，纖維素酶添加量[（纖維素酶質(zhì)量/紫蘇葉粉末質(zhì)量）×100%）]為0.5%～2.5%時，迷迭香酸得率隨著纖維素酶添加量的增加而增加。但是這種增加趨勢并不是呈直線上升態(tài)勢，而是在添加量達到1.5%時，再進一步增加纖維素酶添加量，迷迭香酸得率增幅緩慢。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因主要有兩個方面：一是1.5%的纖維素酶足以充分分解紫蘇葉中的粗纖維，較低的添加量不利于提取；二是添加過多的纖維素酶雖然會使纖維素分解更充分，有利于迷迭香酸提取，但是這種有利效果又會被過多的酶對迷迭香酸的包埋作用抵消。綜合考慮，纖維素酶添加量最佳為2.0%。

2.2 pH的影響

采用纖維素酶輔助提取迷迭香酸，主要是借助纖維素酶對細胞壁纖維的分解作用，使細胞壁破裂以利于細胞內(nèi)容物有效析出。而纖維素酶本身是一種蛋白質(zhì)，具有高酸性、高堿性變性失活的特征，其生物學特性決定了纖維素酶輔助提取法的工藝條件要溫和易控。根據(jù)纖維素酶的這一生物特點，結(jié)合以往研究的成果，研究纖維素酶發(fā)揮最佳活性功能的大致pH范圍。由圖2可知，pH從2.0上升至4.0時，迷迭香酸得率也呈現(xiàn)出伴隨pH上升而增加的趨勢，但當pH超過4.0再進一步增加時，迷迭香酸得率下降明顯。表明采用纖維素酶輔助提取紫蘇葉中迷迭香酸的最佳pH為4.0。

2.3 提取溫度的影響

溫度是影響纖維素酶活性功能的重要環(huán)境條件，提取溫度過低、過高都會使酶的活力降低，進而影響纖維素酶酶解效果，導致迷迭香酸得率降低。由圖3可知，當反應體系提取溫度為50 ℃時，迷迭香酸得率最高，因此確定纖維素酶輔助提取的最佳溫度為50 ℃。

2.4 提取時間的影響

由圖4可知，提取時間在15 min以前，隨著提取時間的延長，迷迭香酸得率逐步提升，但是當超過15 min之后，迷迭香酸得率反而下降。這一方面說明纖維素酶催化的纖維素降解反應需要一定的作用時間，只有在達到一定作用時間后，才能將紫蘇葉的細胞壁充分破碎。另一方面也說明隨著纖維素酶作用時間進一步延長，可能會導致纖維素分解產(chǎn)物與迷迭香酸之間發(fā)生酯化反應，從而又會影響迷迭香酸得率。因此，纖維素酶輔助提取迷迭香酸的最佳提取時間為15 min。

2.5 NaCl濃度的影響

通過在水相中加入不同濃度的NaCl溶液（0～50 g/L），研究NaCl濃度對迷迭香酸得率的影響。結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的增加，得率無明顯變化。因此，試驗選擇不加NaCl。

3 結(jié)論

抗氧化和抑制自由基的課題日益成為研究熱點，迷迭香酸可用于治療自由基引起的多種疾患。對迷迭香酸的研究也在不斷深入，應選擇合理而方便應用的提取方法，以便更好發(fā)揮社會及經(jīng)濟效益。

試驗建立了纖維素酶輔助提取紫蘇中迷迭香酸的工藝條件。纖維素酶輔助提取的最佳工藝條件確定為：纖維素酶添加量2.0%，提取液pH 4.0，提取溫度50 ℃，提取時間15 min。該方法簡單，可重復性強，為下一步進行迷迭香酸的藥效研究打下了基礎。

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