微透析技術(shù)在植物生理生化研究中的應(yīng)用

摘要：微透析是一種可以應(yīng)用于生物體體內(nèi)和體外的樣品處理技術(shù)?？梢耘c多種分析測試儀器耦合，對細(xì)胞外空間或其他水溶液環(huán)境中隨時間、濃度發(fā)生變化的生理活性物質(zhì)提供實時動態(tài)的監(jiān)測信息。其突出優(yōu)點(diǎn)是在不影響生物體正常生長的情況下可以準(zhǔn)確地給出被分析物隨時間的變化情況，而且可以對目標(biāo)生物體進(jìn)行各種處理，以得出被分析物受外界環(huán)境影響下的即時變化情況，而且微透析的樣品在用高精密儀器分析時，無需進(jìn)行樣品前處理，可真正做到實時、在線、廉價的跟蹤檢測研究。闡述了微透析在植物體上的應(yīng)用，微透析技術(shù)應(yīng)用在動物體，主要取樣是細(xì)胞間質(zhì)，在植物體上可以檢測植物質(zhì)外體各種物質(zhì)的變化，克服以往研究質(zhì)外體的瓶頸，還包括了微透析技術(shù)與GC、HPLC、CE等分析儀器的耦合使用研究現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：微透析；植物；質(zhì)外體；HPLC；GC；CE

中圖分類號：O652 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2733-04

Application of Microdialysis Technique in Physiology and Biochemistry of Plant Research

MA Jin-long1，2b，JIANG Guo-bin2a，YAO Shan-jing1，JIN Hua2a，DENG Shao-li2a

（1.Department of Chemical and Biological Engineering， Zhejiang University，Hangzhou 310027，China； 2a. Environment and Resources College； 2b.Life Science College， Dalian Nationalities University， Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： Microdialysis is a sampling technique that can be employed to monitor biological events both in vivo and in vitro， it can be coupled with a variety of analytical instruments， can provide monitoring information for biological active substances changed with time and concentration in other aqueous environment or outside the cells dynamically in realtime. It is advantageous in fast， selective and sensitive analysis while preserving temporal information without affecting the growth of organisms. At the same time， the changes of analyte can be detected immediately in external environment. Furthermore， microdialysis samples without pretreatment， which are coupled with high-precise analytical systems， will realize truly real-time， online and cheap tracking detection.Although microdialysis sampling focusing on intercellular matrix has been applied in animals and human， it has not been extensively employed to detect various material changes in plant apoplast. So microdialysis sampling technique can overcome the bottleneck of previous research on plants. An overview of microdialysis system about principle， probe， membrane and parameters， furthermore sampling for plants and analytical methods employed for online analysis， including gas chromatography （GC）， high performance liquid chromatography （HPLC）， capillary electrophoresis （CE）， and so on， were reviewed.

Key words： microdialysis；plant；apoplast； high performance liquid chromatography （HPLC）； gas chromatography （GC）； capillary electrophoresis （CE）

生物體作為一個活的個體，每時每刻都在進(jìn)行著各種生物、物理、化學(xué)的變化，只有極少數(shù)具有時間上的高分辨率的儀器可以連續(xù)監(jiān)測生物體發(fā)生的變化。微透析儀就是很有力的一種采樣儀器，無論在體內(nèi)還是體外都可以實現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測生物活性分子等物質(zhì)的濃度。自從1996年Bito等[1]首次提出微透析儀器，微透析儀器得到了廣泛應(yīng)用。目前，絕大多數(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域為人體、神經(jīng)學(xué)科、組織藥代動力學(xué)和藥物區(qū)域代謝等方面，可以說主要集中在動物方面。遍及動物體各部位器官包括肝臟、心臟、皮膚、胎盤血、胃和耳朵等。在植物方面的應(yīng)用較少，主要用于監(jiān)測歐洲云杉中乙烯含量[2]， 以及歐洲云杉生長區(qū)中乙烯和玉米素核苷含量變化[3]， 還有植物中Cu2+和Ni+含量的監(jiān)測[4]。

有學(xué)者將微透析技術(shù)應(yīng)用于鵝掌柴和楊樹上取得了一定的進(jìn)展，實現(xiàn)了植物質(zhì)外體內(nèi)含物的實時、在線監(jiān)測[5]，本文主要介紹微透析與多種傳統(tǒng)分析儀器聯(lián)用，在植物生理生化研究中實現(xiàn)實時、在線、無損監(jiān)測，從而深入研究植物的抗逆機(jī)理。

1 微透析系統(tǒng)

1.1 微透析基本原理

微透析（Microdialysis）起源于20世紀(jì)50年代末期，用來描述一種類似于透析的萃取技術(shù)[6]。微透析技術(shù)的基本原理與透析原理相同，即小分子物質(zhì)順著濃度梯度通過半透膜進(jìn)行擴(kuò)散，只是裝置更精巧，采用一種新型同心圓探針，膜區(qū)采用具有不同截留分子量的半透膜材料制成，埋入待測的生物組織區(qū)域內(nèi)，再以恒定的速率向探針內(nèi)灌注等滲灌流液，微透析探針如圖1，當(dāng)灌流液流經(jīng)探針前端透析膜時，探針膜外側(cè)組織內(nèi)可透過半透膜的相對分子質(zhì)量較小的生物活性物質(zhì)，依濃度梯度從膜外擴(kuò)散進(jìn)入透析管內(nèi)，并被透析管內(nèi)連續(xù)流動的灌流液不斷帶出，從而達(dá)到活體組織取樣的目的。

微透析樣品中待測物質(zhì)濃度不能確切代表組織中該物質(zhì)的實際濃度，而且試驗過程中使用空白灌流液不間斷透析，因此不會達(dá)到平衡狀態(tài)，微透析樣品濃度只是該組織部位真實濃度的“片段”，實際濃度應(yīng)恒定地大于透析液中濃度，二者的比率即為相對回收率。

1.2 微透析探針

微透析探針是一段管式半透膜與石英、不銹鋼或者塑料材質(zhì)的管相連，常規(guī)使用的探針外徑一般為200～500 μm，半透膜的截留分子量（MWCO）范圍為5 000～100 000 Da。根據(jù)使用對象的不同，常規(guī)的微透析探針分為兩種4個式樣，即并聯(lián)和串聯(lián)2種，并聯(lián)探針根據(jù)使用材質(zhì)不同分為剛性和柔性2個式樣；串聯(lián)探針根據(jù)使用部位不同，分為線性和環(huán)行2個式樣。在植物中廣泛使用的共3種（圖2），即圓柱型套管探針、線型探針和柔韌型探針。

目前國際上生產(chǎn)微透析探針和系統(tǒng)的公司主要有瑞典CMA和Agnthos公司、美國BAS公司、荷蘭Brainlink BV公司、日本EICOM公司和德國Enka Glantzoff公司，由于微透析一直以來主要應(yīng)用在動物和人體當(dāng)中，因此還沒有生產(chǎn)專門用于植物的微透析探針的公司，現(xiàn)在絕大多數(shù)研究植物微透析都采用動物探針或者自制探針。

1.3 微透析膜

微透析膜主要有如下幾種：親水性透析膜、納米孔透析膜、均質(zhì)膜和離子交換膜。微孔膜的結(jié)構(gòu)類似于一個傳統(tǒng)的過濾裝置，且基本操作原理也相同?？讖酱笮⊥ǔＴ?～10 nm，比傳統(tǒng)的過濾裝置小得多。通常制作透析膜的材料是聚四氟乙烯，還有纖維素酯、聚碳酸酯、聚砜、丙烯腈共聚物、聚縮醛、聚丙烯酸酯、聚電解質(zhì)復(fù)合物、交聯(lián)聚乙烯醇和丙烯酸共聚物如全氟磺酸等，這些材料制作的微透析膜得到廣泛的應(yīng)用。均質(zhì)膜是由均勻的薄膜平均分布在整個界面上。在膜的周圍通過分子擴(kuò)散進(jìn)行傳質(zhì)過程，透析效率取決于溶解度和目標(biāo)物在膜的界面擴(kuò)散程度。離子交換膜沒有常規(guī)的大孔徑，全部是微孔徑，但在成膜聚合物里包含有正電荷或負(fù)電荷離子吸附在孔隙壁上[9]。

影響膜分離效果的因素主要在分離模式或者是探針種類上：膜表面（特殊功能的膜材料）；膜路徑長度（長度越長效果越好）；膜的孔隙率（最重要的影響因素）；膜厚度（考慮傳質(zhì)效率和膜的壽命，選取最適區(qū)間）；膜的幾何形狀（決定接觸面積大小）。

在透析過程中一個重要但容易被忽視的參數(shù)，就是截留分子量（MWCO），這個參數(shù)是由孔徑尺寸決定的。為了在目標(biāo)組分和大分子基質(zhì)之間保證最佳分離效果并且保證時間相對較短，就需要選擇一個最佳的孔徑。這需要在高通量分析和充分去除干擾物之間需求一個平衡。膜厚度和孔隙率（即每單位膜面積的孔隙數(shù)量）往往不出現(xiàn)在科學(xué)文獻(xiàn)中，盡管這些參數(shù)對透析效率影響很大，但是為了獲得樣品高通量分析，很明顯需要使用薄且高度多孔膜[10]。

隨著納米技術(shù)如采用原位影印多孔聚合物集成芯片級微透析膜，使得微透析技術(shù)獲得長足進(jìn)步，納米孔徑微透析膜芯片可以使用相分離聚合技術(shù)即通過一固定形狀的紫外激光束快速而廉價地制作出來?？刂葡喾蛛x過程可以定制不同MWCO的工程膜應(yīng)用到相關(guān)領(lǐng)域。采用兩個不同MWCO的膜，進(jìn)行反向流動模式微透析從樣品中分離出低分子量的目標(biāo)物；第一步采用低的MWCO進(jìn)行蛋白脫鹽，第二步采用較高的MWCO以目標(biāo)物大小為基礎(chǔ)分離蛋白質(zhì)。幾次測試證明了膜均一性、重復(fù)性和低分子量組分通過膜可以快速擴(kuò)散等特性[11]。

1.4 微透析相關(guān)參數(shù)

在微透析技術(shù)中，涉及到如下幾個參數(shù)，需要在試驗操作過程中優(yōu)化和注意：灌流速度；可用于分析的透析液體積；透析液中目標(biāo)物的濃度范圍；分析方法的敏感度和檢測限；灌流液種類；得到有效結(jié)果的測試頻率（有時間限制樣品）。

2 微透析在植物研究方面的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 優(yōu)點(diǎn)

對于生物組織和液體取樣，微透析有幾個明顯的優(yōu)點(diǎn)，特別是與分離分析方法聯(lián)用的時候。透析液通常是含鹽水溶液，其中只含有小分子量物質(zhì)，而細(xì)胞和大分子量物質(zhì)被排除在外，這樣在分析之前則無需離心或者蛋白沉淀的步驟。此外，透析液是通過透析膜擴(kuò)散，流動相沒有去除，因此可以不斷檢測細(xì)胞外液中的物質(zhì)持續(xù)幾個月[12]。這在動物方面可以節(jié)省試驗動物數(shù)量，在植物方面也同樣如此，可以利用少量樣本進(jìn)行長時間檢測，得到可靠的數(shù)據(jù)用以統(tǒng)計分析。由于微透析技術(shù)的微創(chuàng)性，對目標(biāo)生物損害微小，在一株植物上也可放置多個探針，因此可以同時在嫩莖、根部、厚實葉片上同時檢測，并且不影響植株生長，其他檢測植物生理的技術(shù)也可以同時開展，比如葉綠素?zé)晒鈾z測、氣孔檢測、外觀變化等，尤其在研究脅迫下植物生理變化時有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。

2.2 局限性

首先，微透析探針的插入需要熟練的技巧，操作不同對檢測結(jié)果會有不同，尤其在植物表面硬度高的部位需要導(dǎo)引針，并且需要采用生物相容性較好且對結(jié)果影響小的高分子物質(zhì)封閉探針與植物結(jié)合處，保證密封性的同時還方便探針的摘取。其次，微透析灌流液通常都是水溶液，因此分析物被局限于水溶性物質(zhì)。一些檢測高疏水性物質(zhì)的嘗試或多或少有些失敗，但是也有一些報道成功地測量了疏水性物質(zhì)，為了能夠成功地檢測疏水性物質(zhì)，體外試驗表明灌流液采用脂質(zhì)分散劑代替水溶液會起到很好效果。再有，微透析對生物體是一種微創(chuàng)檢測，組織部位不同恢復(fù)情況不同，且需要一定時間。最后，微透析技術(shù)的瓶頸就是傳統(tǒng)分析方法的低靈敏性，因微透析樣品體積少單位以微升記，目標(biāo)物濃度極低。隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展，與HPLC、CE、MS等聯(lián)用可以克服這個困難[13]。

3 微透析與現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用的效果

3.1 微透析與氣相色譜（GC）聯(lián)用

在植物生理生化研究中，乙烯是重要的信號分子，因此檢測乙烯含量也是植物生理研究的重點(diǎn)，微透析可以用于植物不同部位，通過與氣相色譜（GC）聯(lián)用，可以檢測乙烯氣體含量的變化。

3.2 微透析與高效液相色譜（HPLC）聯(lián)用

高效液相色譜（HPLC）是微透析樣品分析中比較傳統(tǒng)的檢測分離方法之一。同樣也分為在線和離線兩種聯(lián)用方式，HPLC進(jìn)樣量一般要求在20 μL左右，因此在傳統(tǒng)植物微透析試驗中，灌流液速度為1 μL/min，需要30 min取樣1次進(jìn)行HPLC檢測。HPLC具有高壓、高效、高速的特點(diǎn)，適合于生化樣品的高效分離分析，且操作簡便。微透析樣品的最大優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)樣前不需要進(jìn)行任何預(yù)處理，因此也可以在線與HPLC聯(lián)用進(jìn)行檢測。透析液通常屬于親水性溶液，因此HPLC中反相色譜和離子交換色譜適合于微透析樣品的直接分析[14]。

3.3 微透析與毛細(xì)管電泳（CE）聯(lián)用

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）是近年發(fā)展起來的一種痕量、高效、快速的分析方法，分析只需要納升或皮升數(shù)量級體積的樣品，并使時間分辨率提高10 s以上[15]。分析速度和分離效率與場強(qiáng)成正比，因此微透析樣品可采用短的毛細(xì)管和高的場強(qiáng)就可達(dá)到非常快速和高效的分離，電泳分析時間從幾秒鐘到幾分鐘即可完畢，這就使得微透析樣品取樣和分析同步進(jìn)行，是分析微透析樣品的理想方法。與HPLC相比，雖然分離效率略差一些，但進(jìn)樣量少，在一定試驗條件下靈敏度強(qiáng)于HPLC。同樣微透析與毛細(xì)管電泳聯(lián)用分為離線和在線兩種。因CE系統(tǒng)僅需幾納升樣品，因此在植物微透析中以1 μL/min速度灌流，通常以5 min為單位收集樣品用于分析，可以檢測快速變化的物質(zhì)，也能采用更低的灌流速度，以增加透析效果，使微透析取樣中得到較高的相對回收率，這是其他分析儀器所無法比擬的。常用的檢測儀器有UV、LIF、ECD和MS等。微透析與CE聯(lián)用最大的優(yōu)勢就是可以實現(xiàn)在線分析，首先樣品不需要純化，CE的即時高分辨率可在短時間內(nèi)同時測定透析液中多種分析物，因而能捕捉植物體內(nèi)瞬間的變化，尤其植物在外界非生物脅迫時，某些信號物質(zhì)濃度變化可精確捕捉。

4 展望

微透析作為一種取樣技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域，是一門多學(xué)科相結(jié)合的取樣技術(shù)，尤其是在體內(nèi)各種內(nèi)源活性生化物質(zhì)的檢測中使用優(yōu)勢更為突出，有著廣闊的應(yīng)用前景。微透析過程可以明顯減少取樣時對生物體的傷害和正常狀態(tài)的影響，使得取樣結(jié)果最大限度地接近所測物質(zhì)在生物體內(nèi)的真實狀態(tài)，可以實現(xiàn)實時、在線取樣和檢測，更可以明確某種活性物質(zhì)在同一生物個體體內(nèi)的隨時間的變化過程，最大可能地消除各種復(fù)雜操作的影響，避免樣本的浪費(fèi)，而且微透析還有包括成本低廉、分析快速和裝置簡單且易操作等優(yōu)點(diǎn)[6]。尤其在分析技術(shù)突飛猛進(jìn)的今天，與多種精密分析儀器的聯(lián)用，更加顯示出其無可比擬的優(yōu)越性。目前微透析技術(shù)還主要集中在動物、人體試驗當(dāng)中，在植物研究中鮮有報道，植物質(zhì)外體一直是植物生理生化研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，微透析可以很好地解決這一問題，未來可以優(yōu)化微透析裝置設(shè)計，以及和多種分析儀器偶聯(lián)在線使用，可以發(fā)展植入式或外掛式微透析裝置，以方便各種情況下生物體的取樣分析。在植物生理研究中，不僅可以檢測質(zhì)外體各種物質(zhì)的變化，還可以與其他傳統(tǒng)檢測同時進(jìn)行，將各種指標(biāo)全方位進(jìn)行綜合檢測對比分析，可以為生理生化研究提供更為立體的研究數(shù)據(jù)，揭示出更多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生理生化機(jī)制。

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