血漿游離FHIT基因雜合性缺失在非小細胞肺癌中的臨床意義*

王 敏 徐釧銘 黃 磊 劉衛(wèi)碩 敖啟林△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院病理研究所,同濟醫(yī)學院病理學系,武漢 430030

2湖北省黃岡市黃州區(qū)人民醫(yī)院,黃岡 438000

3武漢市中心醫(yī)院,武漢 430014

肺癌是目前嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率都很高。如何實現(xiàn)肺癌的早期診斷,以及建立與療效和預后相關(guān)的監(jiān)測指標一直是臨床研究的熱點問題?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些早期肺癌患者的外周血中有循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸(DNA)[1],提示:檢測肺癌患者外周血中的腫瘤DNA,對肺癌患者的診斷、分期和預后的判斷等可能具有重要價值,脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad,FHIT)基因為近年來發(fā)現(xiàn)的新的候選抑癌基因,與大多數(shù)腫瘤發(fā)生密切相關(guān),且是肺癌最常見的變異基因之一[2]。因此我們抽提肺癌和良性肺疾病患者組織及血清中的DNA,通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)-銀染法檢測血漿和組織標本FHIT基因的3個微衛(wèi)星位點D3S1300、D3S1234、D3S4103的雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),并進行比較;同時對相應的組織病理切片進行FHIT蛋白的免疫組化染色,旨在探討循環(huán)核酸FHIT基因突變檢測對肺癌的生物學行為估計、診斷及預后監(jiān)測的參考價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院胸外科2006年6月至2007年5月間未接受放、化療的69例原發(fā)性非小細胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)住院患者,采集患者手術(shù)麻醉前和術(shù)后4～5 d的靜脈血標本(所取標本均獲得患者或家屬知情同意),并收集其手術(shù)切除腫瘤組織的石蠟標本?；颊吣挲g36～78歲,組織學分型以病理診斷為確診依據(jù),其中鱗癌34例,腺癌22例,其他13例,根據(jù)1997年國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer,UICC)修訂的C-TNM標準行TNM 分期:ⅠB期29例,Ⅱ期9例,Ⅲ期 26例,Ⅳ期5例(骨轉(zhuǎn)移2例,肝轉(zhuǎn)移 2例,肝和腦轉(zhuǎn)移1例);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性38例,陰性31例。另選取15例良性肺疾病(機化性肺炎3例,炎性假瘤7例,支氣管擴張5例)患者手術(shù)切除的肺組織并取靜脈血標本,及5例健康人靜脈血作為對照。所有患者均排除糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性相關(guān)性疾病。

1.2 取材方法

69例NSCLC患者術(shù)前1 d,術(shù)后4～5 d各抽取外周靜脈血6～8 mL。術(shù)后2 h內(nèi)在癌中心無明顯出血壞死區(qū)取直徑1～2 cm的組織,置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時收集15例良性肺疾病患者外周靜脈血及組織標本,5例健康志愿者的外周靜脈血標本。

1.3 DNA抽提

取靜脈血6～8 mL置于未添加抗凝劑的真空管內(nèi),室溫靜置1～2 h吸取上層,取淡黃色清亮液至無菌EP管中,立即于4℃條件下以2 500 r/min的速度離心10 min后吸取上層清亮血清。取當次實驗所需血清量,余置于-20℃以備用。分離得到血清后按照血漿基因組DNA快速抽提試劑盒說明提取血漿DNA。新鮮組織標本亦按照組織基因組DNA快速抽提試劑盒說明進行DNA的提取。該試劑盒均購于上海飛捷生物公司。所提取的DNA標本經(jīng)紫外分光光度計定量,吸光度(A)值＞1.75。可疑標本重新提取。

1.4 PCR擴增-銀染及LOH分析

3對微衛(wèi)星位點見表1,來自Genome數(shù)據(jù)庫,均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。在30 μ L PCR反應體系中加入基因組DNA 2 μ L,2.5 μ L 10×PCR緩沖液,dNT P 200 μ mol/L,每對引物各 1 μ L,TaqDNA 聚合酶0.4 μ L。循環(huán)條件為:94℃預變性5 min,94℃變性45 s,61～65℃45 s,72℃1 min,35個循環(huán)后72℃延伸7 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測特異性后,取5 μ L用同體積的甲酰胺變性示蹤液(95%去離子甲酰胺、0.5%二甲苯氰藍、0.5%溴酚藍、20 mmol/L EDTA、5 mmol/L NaOH、25%蔗糖)稀釋,95℃變性 10 min后電泳。含7 mol/L尿素、8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳先在恒流50 mA下預電泳1 h,隨后上樣。恒流5～10 mA電泳3～4 h。取下凝膠,去離子水洗1遍后,用固定液(10%乙醇、0.5%冰乙酸)固定20 min,去離子水洗2遍;染色液(1.5%硝酸銀)染15 min,去離子水洗3遍(＜5 s/遍);顯色液(1.5%NaOH,0.4%甲醛)顯色至條帶清晰,用等體積定影液(0.5%Na2CO3)定影 5 min,水洗2遍 。用保鮮膜包裹,室溫下干膠,永久保存。與自身白細胞對比,癌組織DNA PCR擴增產(chǎn)物帶消失或相對密度減少50%以上時判為 LOH,異常病例需經(jīng)再次PCR電泳證實。

表1 FHIT基因LOH 3個微衛(wèi)星位點擴增序列Table 1 T he amplified sequence of 3 microsatellite loci of LOH at FHIT gene

1.5 免疫組織化學染色檢測FHIT蛋白的表達

石蠟切片采用常規(guī)0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復及LSAB法(親和素蛋白-生物素酶標免疫組化方法)進行免疫組織化學(IHC)染色。一抗為兔抗人FHIT單克隆抗體(即用型),SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行,FHIT基因表達產(chǎn)物定位于細胞質(zhì),呈棕黃色顆粒狀。每張切片在400倍鏡下隨機選定10個視野,每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞,共計1 000個細胞。對陽性細胞所占百分比(＜5%計為1;5%～50%計為2;＞50%計為3)及染色強度(無色計為0;淺黃色計為1;黃色計為2;棕黃色計為3)進行評分。二者相乘,乘積＜3為FHIT蛋白表達顯著減少或缺失,即FHIT蛋白表達陰性;≥3為FHIT蛋白表達陽性。每次實驗均設(shè)對照:以肺癌組織表達陽性切片為陽性對照,以正常肺組織作陰性對照,以TBS替代一抗作空白對照。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析,LOH與各臨床指標間的關(guān)系采用行×列表χ2

檢驗和(或)Fisher精確概率檢驗,NSCLC組織、血漿FHIT的LOH比較用χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與血漿中FHIT基因LOH的特點及與臨床病理的相關(guān)性

PCR-銀染法檢測結(jié)果顯示:FHIT基因的LOH分布于3個微衛(wèi)星位點D3S1300、D3S1234和D3S4103(圖1),肺癌組織中共有50例標本被檢出陽性,總突變率72.5%(50/69例),其中D3S1300位點 LOH 31例,D3S1234位點 LOH 28例,D3S4103位點LOH 20例,同時2個以上位點LOH為29例。50例LOH陽性的組織標本中,其對應血漿中有 37例檢測到相同的 LOH,一致性為74.0%;有4例未發(fā)生LOH的組織標本其對應血漿中檢測到LOH,肺良性病變組織和血漿及健康人血漿均未檢測到LOH。3個微衛(wèi)星位點編號、具體LOH例數(shù)及百分率見表2。

圖1 NSCLC患者組織及血漿中FHIT基因LOH圖譜Fig.1 The LOH map of tissues and plasma at FHIT gene in NSCLC patients

肺鱗狀細胞癌患者血漿FHIT基因發(fā)生 LOH為61.8%(21/34),腺癌患者為 54.5%(12/22),差異無統(tǒng)計學意義(P=0.5917)。肺癌患者術(shù)前血漿LOH在TMN臨床分期中出現(xiàn)的頻率(至少1個位點發(fā)生LOH)為Ⅰ期 51.7%(15/29),Ⅱ期44.4%(4/9),Ⅲ期57.7%(15/26),Ⅳ期60.0%(3/5),差異無統(tǒng)計學意義(P=0.9262);術(shù)后同一患者血漿LOH檢測情況:Ⅰ期0例,Ⅱ期11.1%(1/9),Ⅲ期46.2%(12/26),Ⅳ期60.0%(3/5),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0263)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組術(shù)前血漿的LOH陽性率32.3%(10/31),有局限性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(肺內(nèi)、肺門和/或縱隔淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移)LOH陽性率為71.1%(27/38),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0348);同一患者術(shù)后血漿LOH檢測情況:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的LOH陽性率3.2%(1/31),有局限性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LOH陽性率為47.4%(18/38),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0276)。

表2 肺癌組織與血漿中FHIT基因LOH分布特點Table 2 The characteristic of LOH at FHIT gene in plasma and tumor tissues of patients with NSCLC

2.2 FHIT蛋白免疫組化染色與組織FHIT基因LOH表達的關(guān)系

15例作為對照的正?；蚍悄[瘤肺組織中FHIT蛋白染色均為陽性,FHIT蛋白表達產(chǎn)物定位于細胞質(zhì),呈棕黃色顆粒狀(圖 2)。在 69例NSCLC腫瘤組織中54例(78.3%)有FHIT蛋白表達缺失(圖3),其中有39例(72.2%)存在1個或 2個FHIT基因位點的 LOH;前文肺癌組織50例FHIT基因 LOH的病例中 37例(74.0%)存在FHIT蛋白低表達,兩者相關(guān)性有統(tǒng)計學意義(P=0.0417)。

圖2 FHIT在肺良性病變組織中的免疫組化染色呈強陽性表達(SP法,×200)Fig.2 The strong expression of FHIT immunohistochemical staining in lung tissues of benign lesions(SP method,×200)

圖3 FHIT在肺鱗狀細胞癌中的免疫組化染色呈陰性表達(SP法,×200)Fig.3 The negative expression of FHIT immunohistochemical staining in squamous cell carcinoma of lung(SP method,×200)

3 討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥,5年存活率僅13.9%[3]。其發(fā)生發(fā)展與多種基因異常有關(guān),至今尚缺乏有效的早期診斷和監(jiān)測療效及預后的方法。早在1996年Sozzi等[4]首次報道約80%小細胞肺癌和40%非小細胞肺癌存在FHIT基因的mRNA轉(zhuǎn)錄異常,76%存在FHIT等位基因的雜合性缺失。不僅如此,在肺癌癌前病變中也有FHIT基因的缺失和轉(zhuǎn)錄表達的異常[5],提示FHIT基因異?？赡苁欠伟┌l(fā)生的早期分子事件及肺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。雖然其抑制腫瘤的分子機制尚不清楚,按照Deng等[6]的推測可能是FHIT基因參與細胞周期和細胞凋亡調(diào)控。FHIT基因缺失可導致其功能蛋白質(zhì)表達的缺失,蛋白抑制細胞增殖和(或)促進的功能喪失,從而引起組織細胞異常增生而致使機體腫瘤的發(fā)生。

循環(huán)DNA是存在于人體外周血或者體液中的游離DNA。惡性腫瘤患者血漿/血清中存在高濃度游離DNA,且有研究表明在外周血中循環(huán)核酸與腫瘤核酸的結(jié)構(gòu)或功能上的某些特異變化存在一致性,研究證實,腫瘤患者外周血循環(huán)DNA主要來源于腫瘤細胞的壞死或凋亡、循環(huán)腫瘤細胞或微轉(zhuǎn)移灶的裂解和增殖旺盛腫瘤細胞的釋放[7],并且具有腫瘤DNA的某些特征性改變,如p53基因突變[8]、k-ras基因突變、p16ink4過甲基化等。在NSCLC患者的血漿循環(huán)DNA,許多學者也檢測到了上述腫瘤DNA的特征性變化[9],但關(guān)于FHIT基因LOH的檢測,血漿循環(huán)DNA與腫瘤組織共同報道不多。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿FHIT基因發(fā)生LOH者占癌組織陽性病例的74.0%,說明血漿與NSCLC原發(fā)灶的LOH具有較高的一致性;本實驗中作為對照的5例正常健康人外周血中未檢測到LOH,表明血漿LOH的檢測具有較強的特異性。

既往研究表明,腫瘤患者血漿和組織LOH變異的發(fā)生并非完全一致[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)4例血漿FHIT發(fā)生了LOH,其對應腫瘤組織未檢測到LOH,分析可能原因有:組織中正常細胞如間質(zhì)細胞掩蓋了腫瘤細胞的LOH;血漿中腫瘤循環(huán)DNA濃度太低PCR無法擴增而出現(xiàn)的“人工假像”,也可能是腫瘤細胞存在異質(zhì)性克隆[11]。另外,研究中還有部分病例組織標本發(fā)生了LOH,而其對應血漿中卻未有相同的改變,其原因可能是:僅有少數(shù)或無腫瘤DNA釋放至外周血;正常DNA污染,血漿DNA污染主要源于慢性炎癥或自身免疫性疾病等,如糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關(guān)節(jié)炎等,故選擇病例時需排除之;另血漿FHIT發(fā)生LOH檢出率低于組織中,還可能與血漿中DNA濃度較低、提取方法或檢測方式的敏感性等因素有關(guān),有待于進一步探索更為敏感的檢測方法。

血漿FHIT基因的 LOH與病理類型、臨床分期的關(guān)系目前尚無研究。本研究發(fā)現(xiàn)肺鱗狀細胞癌和肺腺癌患者陽性率差異無統(tǒng)計學意義;Ⅰ～Ⅳ期(TMN分期)的陽性率略有差異但無統(tǒng)計學意義(P=0.5917)。由于Ⅰ期即有51.7%的陽性率,提示有較強的早期診斷意義。

既往研究證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組在血漿中游離DNA的含量上有顯著的差異[12]。本研究發(fā)現(xiàn)沒有轉(zhuǎn)移的肺癌,其血漿FHIT的LOH陽性率為32.3%,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為71.1%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),說明血漿FHIT基因的 LOH檢測對于發(fā)生了轉(zhuǎn)移的肺癌的診斷敏感性更高。

本研究還對所有NSCLC患者術(shù)后外周血進行LOH的檢測,發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ期、有局限性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LOH的檢出率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無局限性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,因此本研究認為手術(shù)前后FHIT基因的LOH檢測在NSCLC的預后判斷上也具有潛在價值。鑒于臨床上缺少簡單可靠的預后判斷指標,進一步研究血漿FHIT的LOH檢測在預后判斷上的意義亦有很大的價值(如治療效果、隨訪觀察等方面)。

比較NSCLC腫瘤組織FHIT基因LOH與蛋白表達的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)72.2%的FHIT蛋白表達減弱或缺失的病例存在FHIT基因LOH,而存在LOH的病例中74.0%FHIT蛋白低表達。癌組織FHIT蛋白低表達與FHIT基因LOH之間有密切的相關(guān)性(P＜0.05),表現(xiàn)為DNA水平和蛋白水平改變的一致性,提示LOH是FHIT基因表達下調(diào)的重要機制。本組15例NSCLC腫瘤組織FHIT蛋白低表達但未檢測到LOH,說明LOH并不是導致FHIT表達下調(diào)的唯一機制。

Zochbauer-Muller等[13]研究發(fā)現(xiàn)FHIT基因啟動子甲基化在肺癌和乳腺癌中是頻發(fā)事件,啟動子甲基化是否參與FHIT表達下調(diào)還有待研究。另外,本研究只檢測了3個發(fā)生LOH頻率最高位點的情況,不排除在其他位點也存在LOH的可能性。

綜上,NSCLC患者血漿與組織FHIT基因的LOH的一致性表達,開辟了應用外周血微創(chuàng)性地進行分子生物學及分子流行病學研究的新途徑。展望未來,NSCLC血漿循環(huán)DNA的基礎(chǔ)及臨床研究將成為倍受矚目的熱點。

[1] Sozzi G,Conte D,Mariani L,et al.Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients[J].Cancer Res,2001,61(12):4675-4678.

[2] Pekarsky Y,Palamarchuk A,Huebner K,et al.FHIT as tumor suppressor:mechanisms and therapeutic opportunities[J].Cancer Biol T her,2002,1(3):232-236.

[3] Molina J R,Yang P,Cassivi S D,et al.Non-small cell lung cancer:epidemiology,risk factors,treatment,and survivorship[J].Mayo Clin P roc,2008,83(5):584-594.

[4] Sozzi G,Veronese M L,Negrini M,et al.The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer[J].Cell,1996,85(1):17-26.

[5] Fong K H,Biesterveed E J,Virmani A,et al.FHIT and FRA3B 3p14.2 allele loss are common in lung cancer and preneoplastic bronchial lesions and are associated with cancer-related FHIT cDNA spicing aberrations[J].Cancer Res,1997,57(11):2256-2267.

[6] Deng W G,Nishizaki M,Fang B,et al.Induction of apoptosis by tumor suppressor FHIT via death receptor signaling pathway in human lung cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,355(4):993-999.

[7] Jahr S,Hentze H,Englisch S,et al.DNA fragments in the blood plasma of cancer patients;quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells[J].Cancer Res,2001,61(4):1659-1665.

[8] 劉衛(wèi)碩,高思海,王敏,等.非小細胞肺癌患者外周血及組織中P53基因突變的研究[J].華中科技大學學報:醫(yī)學版,2008,37(5):587-591.

[9] Paci M,Maramotti S,Bellesia E,et al.Circulating plasma DNA as diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2009,64(1):92-97.

[10] Alan J M,Hardie I D,Briggs J A,et al.Genetic alterations in bronchial mucosa and plasma DNA from individuals at high risk of lung cancer[J].Int J Cancer,2001,91(3):359-365.

[11] Utting M,Werner W,Dahse R,et al.Microsatelite analysis of free tumor DNA in urine,serum,and plasma of patients:a minimally invasive method for the detection of bladder cancer[J].Clin Cancer Res,2002,8(1):35-40.

[12] Depierre A,Lagrange J L,Theobald S,et al.Standards,options and recommendations for the management of non-small cell lung carcinoma patients[J].Bull Cancer,2003,90(2):151-166.

[13] Zochbauer-Muller S,Fong K M,Maitra A,et al.5CpG island methylation of the FHIT gene is correlated with loss of gene ex pression in lung and breast cancer[J].Cancer Res,2001,61(9):3581-3585.