Hedgehog信號通路與Snail在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義

成薇婷 胡作為 田德英

1武漢市第一醫(yī)院腫瘤科,武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科,武漢 430030

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生是多步驟、多階段的過程,由多種基因參與,涉及多條信號通路,發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚[1]。Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎發(fā)育、組織極性的調(diào)控過程中起重要的決定因素,具有高度保守性。長期以來,研究人員推測與胚胎發(fā)育關(guān)系密切的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在癌變過程中具有重要的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路的異常持續(xù)激活和目的基因的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致諸如前列腺癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及胃癌等多種惡性腫瘤[2]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)[3],在HCC組織中Hh信號通路活性異常增強(qiáng),但具體機(jī)制尚不清楚,本研究通過檢測 Hh信號通路的重要組分——信號肽Shh、Ihh、膜受體 Ptch-1 、Smo、轉(zhuǎn)錄因子 Gli-1、Gli-2、Gli-3在各種肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)活性,并分析Hh通路與Snail蛋白之間的關(guān)系,初步探討Hh信號通路與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲之間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝細(xì)胞株 L02和人肝癌細(xì)胞株 HepG2、Hep3B、SMCC-7721和 Huh-7均購自武漢大學(xué)典型生物保藏中心,于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng),每 48 h更換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司),Trizol、引物(Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸分子量DNA Marker(MBI Fermentas公司),TaqDNA 酶(TaKaRa公司),抗Snail多克隆羊抗、抗Gli-2多克隆兔抗(Santa Cruz公司),蛋白提取試劑盒(Panomics公司),ECL發(fā)光試劑(Pierce公司),其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增儀(ABI公司),蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽(Bio-rad公司),Image Master VDS凝膠掃描儀及圖像分析系統(tǒng)(Pharmacia Biotech公司),PCR基因擴(kuò)增儀PE9600(PE公司)。

1.3 RT-PCR檢測

常規(guī)收集生長 72 h的 L02、HepG2、Hep3B、SMCC-7721和Huh-7細(xì)胞,用 Trizol抽提,氯仿、異丙醇和乙醇等制備總RNA,UV2201型紫外分光光度計(jì)測定A260/A280值在1.8～2.0之間。分別取各組總RNA 1 μ L,在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下于37℃合成cDNA。應(yīng)用Premier primer 5.0軟件設(shè)計(jì) Shh 、Ihh 、Ptch 、Smo、Gli-1 、Gli-2、Gli-3、GAPDH引物序列,由Invitrogen公司合成以及純化(表1)。按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Design of RT-PCR primers

1.4 Western blot檢測

采用M-PERTM試劑盒提取新鮮組織蛋白,取20 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,BSA封閉2 h后加入一抗(1∶200)4℃孵育過夜,洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h,常規(guī)洗膜,ECL熒光顯色系統(tǒng)檢測,X線片感光顯影,掃描分析各蛋白條帶結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

有人感慨：如果說下水道代表著一座城市的良心，那么報(bào)刊亭就是城市文化的“唱詩班”。傳承城市文脈，報(bào)刊亭的作用不容小覷。城市不能沒有報(bào)刊亭，城市需要更加美好的報(bào)刊亭。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

Hh信號通路是一經(jīng)典的胚胎發(fā)育和分化信號系統(tǒng),近年來研究發(fā)現(xiàn)該信號的異常激活在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,但是Hh信號在HCC中的作用尚不清楚。

2.2.1 Snail的表達(dá)情況 在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞中,Snail蛋白表達(dá)量較高,但在永生化正常肝細(xì)胞L02中,Snail處于低表達(dá)狀態(tài)(圖2),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

海島是我國海洋國土的重要組成部分，也是海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展及國防建設(shè)的重要基點(diǎn)。海島工業(yè)污染源較少，生活垃圾和生活污水是海島的主要污染來源；隨著海島的開發(fā)和建設(shè)大力推進(jìn)，生活垃圾和污水產(chǎn)量日益增加[1-3]。海島生活垃圾處理方式和設(shè)施的選擇，必須根據(jù)海島生活垃圾產(chǎn)生現(xiàn)狀和理化特征等基本資料和實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)計(jì)。國內(nèi)對生活污染源的研究主要集中于內(nèi)陸農(nóng)村地區(qū)，海島地區(qū)生活污染物排放規(guī)律、理化特性研究較少。我國海島大部分面積較小，多為村鎮(zhèn)級海島。筆者以廣東省2個(gè)村鎮(zhèn)級海島(外伶仃島、東澳島)為研究地點(diǎn)，對生活垃圾產(chǎn)生量、理化特性和生活污水排放系數(shù)、污染物濃度進(jìn)行研究。

2.1.4 Gli mRNA的表達(dá)情況 Gli-1 mRNA在SMMC-7721細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)顯著強(qiáng)于 L02細(xì)胞,均是其的 2.9倍(P＜0.01),在HepG2細(xì)胞的表達(dá)量較 L02細(xì)胞低(P＜0.01),Huh-7細(xì)胞的表達(dá)量與 L02細(xì)胞無明顯差異(P＞0.05);Gli-2 mRNA在L02細(xì)胞中幾乎不表達(dá),但在4種肝癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)較高表達(dá),特別是在SMMC-7721細(xì)胞中,表達(dá)強(qiáng)度尤為顯著,各組表達(dá)量與L02細(xì)胞相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)(圖1B);Gli-3 mRNA在所有的肝細(xì)胞系中表達(dá)強(qiáng)度相似,均較弱,提示在肝癌細(xì)胞中該轉(zhuǎn)錄因子的活性很低。見圖1。

2.1.1 Hh mRNA的表達(dá)情況 在5種肝細(xì)胞系中Shh mRNA表達(dá)程度均較強(qiáng),其中 Huh-7、SMMC-7721、Hep3B細(xì)胞中Shh mRNA的表達(dá)強(qiáng)度均高于L02細(xì)胞,分別是L02細(xì)胞的3.5倍、3.0倍、1.8 倍(均 P ＜0.01,圖 1),而 HepG2中 Shh mRNA的表達(dá)量與L02相近(P＞0.05)。Ihh在所測的5種肝細(xì)胞系中,表達(dá)均較弱(圖1)。

2.1.3 Smo mRNA的表達(dá)情況 Smo mRNA在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)量最高,其次是HepG2和Hep3B細(xì)胞,分別是L02細(xì)胞表達(dá)量的3.7倍、3.0倍和2.3倍(均P＜0.01),而Huh-7中Smo mRNA的表達(dá)則低于永生化細(xì)胞L02(圖1)。

2.1.2 Ptch-1 mRNA的表達(dá)情況 Ptch-1既是Hh信號肽的膜受體,又為Hh信號通路的目的基因,其表達(dá)強(qiáng)度在一定程度上可以代表Hh信號的活性程度。在5種肝細(xì)胞系中,Ptch-1 mRNA均有強(qiáng)度不等的表達(dá),其中以SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度最高,是L02細(xì)胞的2.8倍,在Hep3B細(xì)胞的表達(dá)也是L02細(xì)胞的1.8倍(均 P＜0.01)(圖1)。

2.2 Western blot結(jié)果

控制器主要負(fù)責(zé)幫助應(yīng)用程序穩(wěn)定運(yùn)行及接受瀏覽器的終端的請求?？刂破髟诟鱾€(gè)層面中間的工作、把控應(yīng)用程序各個(gè)環(huán)節(jié)以及處理具體事件方面做出相應(yīng)。其中的事件包含用戶個(gè)人行為與信息模型上發(fā)生的變化。它接受廣大用戶的輸入并通過模型與視圖去滿足用戶的需求，當(dāng)用戶點(diǎn)擊網(wǎng)絡(luò)頁面中的地址或是傳送HTML表格時(shí)，控制器不進(jìn)行任何指令，只是單純的接受請求并決定使用哪個(gè)模型組件去處理網(wǎng)絡(luò)端口傳來的請求。隨后在進(jìn)一步?jīng)Q定用哪個(gè)視圖來呈現(xiàn)模型處理返回的信息。

2.2.2 Gli-2的表達(dá)情況 與mRNA表達(dá)情況一致,Gli-2蛋白在正常肝細(xì)胞株L02中的表達(dá)極其微量,而在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中,Gli-2的表達(dá)量異常增高(圖2),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Spearman秩相關(guān)分析顯示,在SMMC-7721與L02兩種肝細(xì)胞中,Gli-2與Snail蛋白表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.503,P＜0.05)。

圖2 Western blot檢測Snail和Gli-2在L02與SM MC-7721細(xì)胞株中的表達(dá)差異Fig.2 Differentrial expression of Snail and Gli-2 gene in L02 and SMMC-7721 cells

3 討論

4種肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝細(xì)胞系L02中,Hh信號通路的重要組成成分信號肽Hh(Shh、Ihh)、膜受體(Ptch、Smo)與轉(zhuǎn)錄因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3)的 mRNA均有不同程度的表達(dá)(圖1)。

Hh信號通路有3個(gè)同源基因,分別是 Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh),其受體是跨膜蛋白 Ptch。當(dāng)Hh不存在的時(shí)候,Ptch和Smo組成受體復(fù)合物。當(dāng)Hh與Ptch結(jié)合后,Smo被激活,并將信號下傳,激活轉(zhuǎn)錄因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3),后者進(jìn)入細(xì)胞核,啟動(dòng)下游目的基因的表達(dá)[2]。Hh信號通過Gli不僅調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖與分化,也參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散。研究表明,Shh[4-8]或Ihh[9]信號的異常激活可以引起多種腫瘤的形成和發(fā)展,如神經(jīng)管細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌以及食管癌等。Ptch是Hh信號肽的膜受體,與Hh蛋白結(jié)合后,促進(jìn)信號的下傳并激活下游一系列因子,同時(shí)Ptch與Gli一樣,也是Hh信號通路的目的基因,其表達(dá)水平反映了信號通路的活性程度。Berman等[5]采用定量RT-PCR的方法檢測了 15例胰腺癌標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)Ptch mRNA在胰腺癌組織的表達(dá)水平是鄰近正常組織的448倍。同樣,在胰腺癌細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)了 Ptch表達(dá)的增強(qiáng)[6]。Ma等[10]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌中存在Ptch和Gli-1的過表達(dá),利用特異性抗體阻斷Shh信號通路后,能抑制5種胃癌細(xì)胞的生長。Regl等[11]檢測了21例基底細(xì)胞癌標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)Gli-2的水平是正常角質(zhì)細(xì)胞的2～67倍,并且與Gli-1相互促進(jìn)表達(dá)有助于基底細(xì)胞癌的發(fā)生。

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman等級相關(guān)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

付玉看看天。天上有幾只鳥雀飛過，像刀片在她記憶里劃了一道黑色的弧線。馬路兩邊的老槐樹上，有蟬在叫，叫聲像白花花的魚鱗，瓦片般在地上滾動(dòng)。

在成熟的正常肝細(xì)胞中Hh信號通路處于抑制狀態(tài)[5],我們發(fā)現(xiàn)在4種肝癌細(xì)胞株中,與永生化胎肝細(xì)胞L02相比,Hh信號通路各組成分子中Shh、Ptch 、Smo 、Gli-1 、Gli-2 的表達(dá)大多顯著上調(diào) ,說明肝癌細(xì)胞的Hh信號通路活性增強(qiáng)。Shh表達(dá)活性增高,而Ihh的表達(dá)量很低,提示在HCC中,Hh信號通路是以Shh為主要的信號配體。SMMC-7721細(xì)胞是具有較高惡性程度和轉(zhuǎn)移活性特征的細(xì)胞株,與其他惡性程度和轉(zhuǎn)移活性較低的肝癌細(xì)胞株相比,Hh通路活性異常增強(qiáng),這提示Hh信號通路的激活可能與肝癌細(xì)胞的分化、增殖能力以及侵襲力密切相關(guān)。最為顯著的是,在Hh的各種組成分子中,轉(zhuǎn)錄因子Gli-2在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)異常顯著,而L02幾乎不表達(dá)Gli-2,說明在肝癌細(xì)胞中,Hh信號通路通過Gli-2激活下游的目的基因的轉(zhuǎn)錄,此現(xiàn)象與我們在臨床標(biāo)本中的檢測結(jié)果一致,并進(jìn)一步驗(yàn)證了Hh信號通路,特別是核轉(zhuǎn)錄因子Gli-2與HCC的惡性程度密切相關(guān)。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transtions,EMT)是惡性腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中重要生物學(xué)現(xiàn)象,其特征是細(xì)胞ECad、α、β、γ-連環(huán)素等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低或消失,FSP1、波形蛋白、α-SMA和 N-連環(huán)素等多種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá),且侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。Snail是一種編碼鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄因子,參與了乳腺癌、卵巢癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn),Snail不僅可通過下調(diào)E-cadherin表達(dá)降低細(xì)胞黏附力,還可通過上調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)增加肝癌細(xì)胞的侵襲能力,誘發(fā)EM T,促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。利用特異性阻斷劑Cyclopamine阻斷胰腺癌細(xì)胞中Hh信號通路,可下調(diào)Snail表達(dá),顯著抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲力[13]。本實(shí)驗(yàn)中,SMMC-7721細(xì)胞為具有較強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移特性的肝癌細(xì)胞株,其Hh信號通路活性最強(qiáng)。為了進(jìn)一步明確Hh是否參與了肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,我們利用Western blot檢測了 Snail和Gli-2蛋白在SMMC-7721和 L02兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在 SMMC-7721細(xì)胞中Gli-2的蛋白表達(dá)水平顯著增高,而L02細(xì)胞中Gli-2僅有極微弱表達(dá)。與此相同的是,Snail蛋白在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)量也顯著高于L02細(xì)胞,且相關(guān)性分析顯示,Gli-2的蛋白表達(dá)與Snail呈正相關(guān)。已知 Hh信號通路可以激活Snail,這提示在肝癌細(xì)胞中,異常激活的Hh信號通路可能通過增強(qiáng)Gli-2活性,激活了其下游的目的基因Snail,從而使肝癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲的能力,易于向周圍組織擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移。

經(jīng)過多年研究，特別是近10年的攻關(guān)和示范，我國二氧化碳驅(qū)油埋存基礎(chǔ)理論研究和工程技術(shù)有了重大進(jìn)展，形成了二氧化碳混相驅(qū)、非完全混相驅(qū)室內(nèi)試驗(yàn)評價(jià)、氣驅(qū)方案設(shè)計(jì)、全過程數(shù)值模擬實(shí)時(shí)跟蹤及調(diào)整技術(shù)、二氧化碳分層注采集輸工藝技術(shù)、二氧化碳腐蝕與防護(hù)技術(shù)、二氧化碳綜合監(jiān)測和風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)、驅(qū)油及埋存選址和容量評估等技術(shù)，為大規(guī)模推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

綜上所述,Hedgehog信號通路在肝癌細(xì)胞中的異常激活提示該通路在HCC的發(fā)病機(jī)制中可能起到了重要的作用,積極探討Hh信號通路對HCC的影響,對HCC的早期診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義。

[1] 欽倫秀,孫慧川,湯釗猷.原發(fā)性肝癌研究進(jìn)展[J].中華外科雜志,2006,44(15):1070-1074.

[2] Rubin L L,de Sauvage F J.Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(11):1026-1033.

[3] 成薇婷,田德英,許凱.Gli-2在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與CyclinD1、p21的關(guān)系[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,37(4):435-438.

[4] Masaru K.Networking of WN T,FGF,Notch,BMP,and Hedgehog signaling pathways during Carcinogenesis[J].Stem Cell Rev,2007,3(1):30-38.

[5] Berman D M,Karhadkar S S,Maitra A,et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in g rowth of digesstive tract tumors[J].Nature,2003,425(6960):846-851.

[6] T hay er S P,M agliano M P,Heiser P W,et al.Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis[J].Nature,2003,425(6960):851-856.

[7] Oro A E,Higgins K M,Hu Z,et al.Basal cell carcinomas in mice overexpressing sonic hedgehog[J].Science,1997,276(5313):817-821.

[8] Fendrich V,Waldmann J,Esni F,et al.Snail and Sonic Hedgehog activation in neuroendocrine tumors of the ileum[J].Endocr Relat Cancer,2007,14(3):865-874.

[9] Grachtchouk M,Mo R,Yu S,et al.Basal cell carcinomas in mice overexpressing Gli-2 in skin[J].Nat Genet,2000,24(3):216-217.

[10] Ma X,Chen K,Huang S,et al.F requent activation of the hedgehog pathway in advanced gastric adenocarcinomas[J].Carcinogenesis,2005,26(10):1698-1705.

[11] Regl G,Neill G W,Eichberger T,et al.Human GLI2 and GLI1 are part of a positive feedback mechanism in basal cell carcinoma[J].Oncogene,2002,21(36):5529-5539.

[12] Yang M H,Chen C L,Chau G Y,et al.Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009,50(5):1467-1474.

[13] Feldmann G,Dhara S,Fendrich V,et al.Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancerinvasion and metastases:A new paradigm for combination therapyin solid cancers[J].Cancer Res,2007,67(5):2187-2196.