糯玉米基因組DNA提取方法的比較

摘 要：以糯玉米的胚為材料，采用SDS法、CTAB法和堿煮法提取糯玉米基因組DNA，樣品經(jīng)紫外分光光譜吸收、瓊脂糖電泳、PCR擴(kuò)增和酶切試驗(yàn)檢測(cè)，表明SDS法所提DNA濃度較高，質(zhì)量較好；CTAB法提取的DNA中氯仿等殘留量少，安全、經(jīng)濟(jì)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性；而堿煮法提取的DNA濃度較低，但提取過(guò)程簡(jiǎn)單，使用的藥品少，快速，適合用于PCR快速檢測(cè)所需DNA。

關(guān)鍵詞：糯玉米；基因組DNA；種胚；提取

中圖分類號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）15-19-03

Comparison on Three Methods of Extracting Waxy Maize Genomic DNA

Zhao Qiancheng et al.

（College of Plant Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China）

Abstract：The genomic DNA was extracted from dry seed of waxy maize embryo as material while using the method of SDS，CTAB and NaOH buffer.After detected by UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis，the DNA extracted by the SDS method had high purity and integrity，and the DNA extraction of CTAB buffer had advantages of economy，safety with high practicality，which could completely meet the needs of RAPD-PCR and the digestion of the restriction endonuclease.But the extracted DNA using NaOH buffer were low concentration，which suitable for the required DNA of the rapid detection of PCR with advantages of simple，rapid process，and less drugs.

Key words：Waxy corn；Genomic DNA；Embryo；Extraction

糯玉米其質(zhì)粘軟、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，深受廣大城鄉(xiāng)居民的喜愛(ài)，隨著消費(fèi)市場(chǎng)日益擴(kuò)大，巨大的市場(chǎng)需求潛力促進(jìn)了糯玉米遺傳育種的改良，目前我國(guó)糯玉米遺傳育種正處于一個(gè)最佳的快速發(fā)展期[1]。

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，分子育種技術(shù)逐漸滲透到糯玉米育種工作中，以DNA多態(tài)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記在糯玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、雜種優(yōu)勢(shì)群劃分、品種純度鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面得到廣泛應(yīng)用[2]?？焖偬崛「哔|(zhì)量基因組DNA是進(jìn)行分子標(biāo)記等分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)[3]。有關(guān)植物基因組DNA提取方法的研究報(bào)道很多，主要有CTAB法和SDS法[4]，且多采用植物的葉片提取基因組DNA的方法，季節(jié)性明顯。本研究以糯玉米種子的胚（浸泡后）為提取材料，采用SDS法、CTAB法和堿煮法提取糯玉米基因組DNA，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較分析，以滿足糯玉米分子育種的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 糯玉米雜交種鳳糯2146，由安徽科技學(xué)院玉米育種安徽省工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)試劑 DNA提取液1（1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA，5mol/L NaCl，1.5%SDS）、TE緩沖液1（1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA提取液2（0.4%NaOH），TE緩沖液2（1mol/L Tris-HCL，0.5mol/L EDTA，0.5 mol/L HCl）、3mol/L NaAc溶液、5mol/L NaCl溶液、2%CTAB提取液（83.5mmol/L Tris-HCl，pH8.0，16.7mmol/L EDTA，1.17mmol/L NaCl，2.0% CTAB）、70%乙醇、無(wú)水乙醇、異丙醇，4S green核酸染色液（上海生工）等。

1.3 試驗(yàn)主要儀器 PCR基因擴(kuò)增儀（東勝EDC-810）、全自動(dòng)凝膠成像分析儀（培清JS-680D）、電泳儀（君意東方JY—3000）、雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（TV-1901）等。

1.4 試驗(yàn)方法 分別采用SDS法、CTAB法和堿煮法提取糯玉米基因組DNA。（1）SDS法參照趙久然等[5]方法，略作改動(dòng)，其步驟如下：剝?nèi)〗莺蟮呐从衩追N子胚2粒，加入100μL的氯仿快速研磨后裝入2mL的離心管中加入500μL的提取液1混勻后靜置5min，10 000rpm/min離心5min，吸取上清液，預(yù)先裝有500μL異丙醇和500μL的NaCl溶液，放入-20°C的冰箱20min，挑取成團(tuán)的DNA，用70%乙醇洗滌2～3次后，晾干，加入TE緩沖液1完全溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩＃?）CTAB法參照李藝等[6]方法，略作改動(dòng)，方法如下：剝?nèi)〗莺蟮呐从衩追N子胚2粒，快速研磨后裝入2mL的離心管中再加入400μL的氯仿10min（期間振蕩3次左右），加入600μL的CTAB溶液，放入65°C水浴鍋中加熱10min，冷卻至室溫后，10 000rpm/min 離心4min，吸取上清液加入1/5體積的NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，挑取成團(tuán)的DNA，用70%乙醇洗滌2～3次后，晾干，加入TE緩沖液1完全溶解，-20℃保存?zhèn)溆?。?）堿煮法參照趙久然等[5]方法，其方法如下：剝?nèi)〗莺蟮呐从衩追N子胚2粒，放入2mL的離心管中后加入300μL 0.1mol/L的NaOH溶液研磨至勻漿，沸水加熱5min，8 000rpm/min離心5min，吸取上清液至新離心管中，加入TE緩沖液2 300μL，備用。

取DNA樣品各1μL，分別加入199μL TE，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度和純度；取DNA樣品的溶液8μL，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，置恒定電壓100V分離50min后4S green染色10min，于凝膠成像儀上進(jìn)行觀察并拍照。

1.5 基因組DNA酶切反應(yīng) 取SDS法和CTAB法的DNA溶液樣品各8.5μL，加入EcoRⅠ 1.0μL和10×Buffer 2μL，無(wú)菌水8.5μL，放入37°C水浴鍋中，酶切過(guò)夜，1.0%瓊脂糖凝膠電泳50min后4S green染色，在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 將提取的DNA作為模板，用購(gòu)自上海生工的隨機(jī)引物s101、s161、s164、s402、s423進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL體系：包括DNA 1.0μL，10×Buffer 2.0μL，2.5mmoldNTP 1.5μL，dd水14.3μL 1UTag酶0.2μL，2mmol/L引物1.0μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；95℃ 1min，36℃ 90s，72℃ 90s，最后72℃延伸10min，共35個(gè)循環(huán)，待其溫度降至4℃時(shí)，取出后進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA樣品純度分析 用紫外分光光度計(jì)分別對(duì)SDS法、CTAB法和堿煮法所提取的糯玉米基因組DNA樣品進(jìn)行濃度檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可看出，用SDS法提取的糯玉米基因組DNA OD260/280的比值在1.8左右，表明相對(duì)于CTAB法和堿煮法所提取的DNA純度較高，且濃度達(dá)到了1.3μg/μL以上；而CTAB法和堿煮法所提取DNA OD值均低于1.8，表明其DNA樣品中含有一定量的蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)。

表1 3種方法提取糯玉米DNA濃度檢測(cè)結(jié)果

[項(xiàng)目＼序號(hào)＼260nm

吸光值＼280nm

吸光值＼OD260/280＼DNA濃度（μg/μL）＼堿煮法＼1＼0.087＼0.054＼1.611＼0.870＼2＼0.084＼0.054＼1.556＼0.840＼CTAB法＼1＼0.101＼0.061＼1.656＼1.010＼2＼0.099＼0.056＼1.769＼0.990＼SDS法＼1＼0.130＼0.070＼1.857＼1.300＼2＼0.136＼0.072＼1.889＼1.360＼]

2.2 DNA樣品質(zhì)量檢測(cè) 分別吸取用CTAB法、堿煮法和SDS法提取的糯玉米基因組DNA樣品溶液各8μL，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，4S green核酸染液染色，檢測(cè)樣品DNA質(zhì)量，其結(jié)果如圖1所示。

注：1、2泳道為CTAB法所提DNA；3、4泳道為堿煮法所提DNA；5、6泳道為SDS法所提DNA

圖1 3種方法提取糯玉米DNA質(zhì)量電泳結(jié)果

從圖1可以看出SDS法（圖1中的5，6）所提取的糯玉米基因組DNA相對(duì)于其它2種方法的質(zhì)量較高，完整性較好，未出現(xiàn)拖尾、降解，DNA條帶整齊度一致；CTAB法（圖1中的1、2）提取的樣品DNA出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，整齊度尚可，質(zhì)量一般；而用堿煮法所提取DNA（圖1中的3、4）在瓊脂糖電泳中未檢測(cè)出任何條帶，膠孔處發(fā)亮，表明所提DNA質(zhì)量差，樣品中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多。

2.3 DNA樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果 將3種方法所提取糯玉米基因組DNA用隨機(jī)引物進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：1～5為堿煮法；6～10為CTAB法；11～15為SDS法；16為DNA Marker。1、6、11所用隨機(jī)引物為s101；2、7、12所用隨機(jī)引物為s161；3、8、13所用隨機(jī)引物為s164；4、9、14所用隨機(jī)引物為s402；5、10、15所用隨機(jī)引物為s423。

圖2 3種方法提取DNA溶液的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖2可以看出，3種方法所提糯玉米基因組DNA樣品都可以用于RAPD-PCR擴(kuò)增分析，能夠擴(kuò)增出不同的帶型；但SDS法（圖2中11～15）和CTAB法（圖2中6～10）所擴(kuò)增的帶型基本一致，且清晰明亮；而堿煮法也能夠擴(kuò)增出相似的帶型，如圖2中1～3與CTAB法的6～8和SDS法的11～13非常一致。在相同引物下，1與6、11相比，少了一條帶型，而9與4、14相比，帶型相差較大，這可能是由RAPD的穩(wěn)定性差所導(dǎo)致的。堿煮法和SDS法、CTAB法相比所提DNA含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)多，濃度低些，但不影響PCR擴(kuò)增效果，所以這3種方法所提糯玉米基因組DNA可以滿足RAPD分子標(biāo)記分析的需要。

2.4 DNA樣品酶切反應(yīng) 對(duì)CTAB法、SDS法所提糯玉米基因組DNA樣品用內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行20μL體系的酶切反應(yīng)，其酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可看出，經(jīng)EcoRⅠ酶切后的DNA（圖3中2、4）均呈現(xiàn)一片模糊的條帶，與未酶切（下轉(zhuǎn)45頁(yè)）（上接20頁(yè)）的DNA樣品（圖3中1、3）相比，沒(méi)有明顯的主帶出現(xiàn)。說(shuō)明SDS法和CTAB法所提糯玉米基因組DNA樣品能夠獲得比較理想的酶切效果。

注：1、未酶切的CTAB法所提DNA；2、酶切的CTAB法所提DNA；3、未酶切的SDS法所提DNA；4、酶切的SDS法所提DNA

圖3 CTAB法和SDS法提取DNA樣品的酶切反應(yīng)

3 小結(jié)和討論

DNA的提取是作物分子輔助育種的基本環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)用SDS法、CTAB法和堿煮法均可以從糯玉米的胚中提取DNA，但是3種方法提取DNA的質(zhì)量有差別。從試驗(yàn)結(jié)果分析可知，CTAB法和SDS法提取的DNA質(zhì)量較高，可以滿足分子生物學(xué)酶切實(shí)驗(yàn)和PCR擴(kuò)增，而堿煮法提取的DNA質(zhì)量較差，只能用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，且濃度較低；這與王偉等[7]在普通玉米所做試驗(yàn)結(jié)果一致。

SDS法的優(yōu)點(diǎn)是提取DNA濃度較大，質(zhì)量比較高，但試驗(yàn)過(guò)程要使用到氯仿等有毒物質(zhì)，過(guò)程較為繁瑣，適合提取高質(zhì)量的DNA；CTAB法提取的DNA質(zhì)量一般，提取過(guò)程較經(jīng)濟(jì)、安全；堿煮法提取的DNA的濃度較低，但過(guò)程非常簡(jiǎn)單，使用的藥品少，適合用于PCR大量快速檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的研究[4-5]。

試驗(yàn)中所用材料為糯玉米種子的胚，種胚DNA中父母本的貢獻(xiàn)相同，被廣泛用作鑒定雜種F1真實(shí)性的材料[8]。在用糯玉米胚提取DNA時(shí)，種胚應(yīng)充分研磨成細(xì)粉末，以完全破壞細(xì)胞膜，使DNA釋放到液相環(huán)境，還應(yīng)用氯仿重復(fù)進(jìn)行抽提，盡量除去多余的蛋白質(zhì)，以提高所提DNA的質(zhì)量[3]。

采用不同的方法提取糯玉米基因組DNA在純度、濃度、質(zhì)量、完整性等方面都有一定的差異，在試驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的目的和條件來(lái)選擇恰當(dāng)?shù)奶崛》椒ǎ瑥亩_(dá)到事半功倍的效果。

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