熒光假單胞菌FL10的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

摘 要：從海水對蝦養(yǎng)殖池水中篩選到一株對部分水產養(yǎng)殖病原菌有較強拮抗作用的熒光假單胞菌FL10，并對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結果顯示FL10的最佳發(fā)酵條件為：KB培養(yǎng)基（蛋白胨20g，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO4 1.5g，甘油10mL，水1 000mL），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵起始pH值為7，發(fā)酵時間為36h，接種量5%，250mL的三角瓶裝量為100mL。

關鍵詞：熒光假單胞菌；篩選；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號 Q936 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）11-22-03

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescent）是一類革蘭氏陰性桿狀細菌。自20世紀70年代被確認為可開發(fā)利用的生防細菌以來，人們已經分離到大量拮抗植物病害的熒光假單胞菌，這些菌可產生多種抗生素[1-2]，對多種植物病害具有拮抗作用，起到天然生物防治的作用[3]，同時熒光假單胞菌對植物也有促生長的功能[4]。熒光假單胞菌是植物根際最普遍的生物類群，所以常用的篩選源是土壤[5-6]。本研究從海水對蝦養(yǎng)殖池中篩選到了一株具有抗菌效果的熒光假單胞菌，并研究了該菌株在不同培養(yǎng)條件下的抗菌效果，為進一步開發(fā)利用該菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 水樣 水樣選自福建同安某海水對蝦養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖池水。

1.2 儀器設備 玻璃器皿、臺式搖床、電子天平、超凈工作臺、試管、接種環(huán)、移液槍、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 目標菌的篩選

1.3.1 篩選培養(yǎng)基 采用LB培養(yǎng)基作為篩選用的培養(yǎng)基，配方為：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，瓊脂20g，水1 000mL。

1.3.2 目標菌篩選 取1mL水樣按照梯度稀釋法對水樣進行稀釋，然后取0.1mL的各稀釋樣采用涂布平板法進行目標菌的分離純化。用接種環(huán)挑取單菌落接種至裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，搖勻，并放置到臺式搖床中，設置臺式搖床的參數(shù)（37℃、200r/min），振蕩培養(yǎng)32h后，采用離心的方法去除菌體，得到發(fā)酵上清液，并檢測上清液的抑菌效果。

1.4 目標菌株的形態(tài)特征和菌株鑒定 通過采用梯度稀釋法和涂布平板法篩選所得到的目標菌株，用接種環(huán)接種到LB固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長出后，仔細觀察菌落的形態(tài)特征，并做理化鑒定實驗。另外純菌滅活送至上海生物工程有限公司進行菌株的16s rDNA鑒定。

1.5 發(fā)酵上清液抗菌活性的檢測 以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為指示菌，制成菌懸液，采用瓊脂擴散法（agar diffusion method）進行測定[7]。通過測量圓形的透明帶（抑菌圈）直徑的大小來表示發(fā)酵上清液抑菌活性的強弱。

1.6 目標菌抑菌譜檢測 選擇水產養(yǎng)殖常見致病菌包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等作為抗菌譜檢測菌（這些檢測菌均來自于本實驗室），按如上1.5方法，進行目標菌發(fā)酵上清液對這些病原菌的抑菌作用檢測，得出目標菌的抑菌譜。

1.7 發(fā)酵條件優(yōu)化 發(fā)酵條件優(yōu)化方案參照文獻[8]的方法進行，包括培養(yǎng)基、溫度、pH值、發(fā)酵時間、接種量、裝瓶量，其中條件梯度依據(jù)實驗菌種的特性做適當調整，具體發(fā)酵條件選擇如下：

以上發(fā)酵條件優(yōu)化實驗除了目標考察因素外，發(fā)酵培養(yǎng)條件均控制在37℃、200r/min，發(fā)酵后采用離心分離制備發(fā)酵上清液，并檢測發(fā)酵上清液的抑菌效果，每個水平設定3個重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果及目標菌的初步鑒定 經抑菌效果檢測，在候選菌株No.1至No.17中，菌株No.10抑菌活性最強，選其為目標菌，命名FL10。FL10在LB固體培養(yǎng)基上能較好的生長，菌落微隆起，乳黃色，邊緣光滑，表面較濕潤。

菌株理化特性方面的鑒定結果為：革蘭氏染色陰性，有鞭毛具有動力，能液化明膠，葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵均為陽性，水解淀粉陰性，檸檬酸鹽發(fā)酵陽性，接觸酶反應陽性，脂酶反應陰性。

根據(jù)該菌理化特性，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，結合上海生物工程有限公司測得16s rDNA序列數(shù)據(jù)庫進行比對，可以初步確定該菌株為熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescent）。

2.2 FL10的抑菌譜 FL10的發(fā)酵上清液對所選擇的主要水產致病菌的拮抗試驗結果如表1所示。

以上拮抗試驗結果表明，F(xiàn)L10對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均有很強的抑制作用，其中嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、和溶藻弧菌都是水產養(yǎng)殖常見致病菌。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)基成分條件的優(yōu)化 如圖1所示，F(xiàn)L10在7種不同培養(yǎng)基中發(fā)酵均能能產生一定得抑菌效果，但效果差異明顯，在KB培養(yǎng)基中發(fā)酵的抑菌效果最好，所以KB培養(yǎng)基作為最適培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對FL10菌株抗菌效果的影響

2.3.2 不同培養(yǎng)溫度梯度對FL10菌株抗菌效果的影響 選用最適KB培養(yǎng)基，設定不同梯度發(fā)酵培養(yǎng)溫度為22℃、26℃、30℃、34℃、37℃，經發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測抑菌效果，如圖2所示。在設定的溫度范圍內，F(xiàn)L10勻有出現(xiàn)較好的抑菌效果，其中發(fā)酵溫度控制在30℃時抑菌效果最好，34℃下抑菌效果次之，因此最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對FL10菌株抗菌效果的影響

2.3.3 不同pH值對FL10菌株抗菌效果的影響 培養(yǎng)基的起始pH直接影響到熒光假單胞菌的菌體生長，進而影響到抗菌物質分泌的量。用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基調整不同的pH進行實驗，如圖3所示。pH值對FL10菌株抗菌效果影響較大，在pH值為3、4、9條件下沒有看到抗菌效果，pH值在5～8范圍內可看到抑菌效果，但差異較大，其中pH值為7時抗菌效果最好，所以最適pH值應為7。

圖3 不同pH對FL10菌株抗菌效果的影響

2.3.4 不同發(fā)酵培養(yǎng)時間對FL10菌株抗菌效果的影響 選用最適KB培養(yǎng)基，經梯度稀釋和涂布平板法進行分離純化后，接種FL10菌株，發(fā)酵12h后開始每隔6h取1次樣，檢測發(fā)酵上清液的抗菌效果。從圖4中可以看出，在12～36h區(qū)間，隨著發(fā)酵時間的延長，抗菌效果也有所增強，36h時抗菌效果達到最大。繼續(xù)培養(yǎng)（36～60h區(qū)間）抑菌效果也隨之下降。所以最佳發(fā)酵時間為36h。

圖4 不同培養(yǎng)時間對FL10菌株抗菌效果的影響

2.3.5 不同接種量對FL10菌株抗菌效果的影響 本實驗以1%、3%、5%、7%、10%接種量分別進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果如圖5所示。接種量為5%時抗菌效果最好，10%抗菌效果最差，這主要是接種量的大小對發(fā)酵單位有較大的影響，合適的接種量更為重要，并不是接種量越大抗菌效果越好，通過本實驗得出FL10的最佳接種量應為選擇5%。

圖5 不同接種量對FL10菌株抗菌效果的影響

2.3.6 不同裝瓶量對FL10菌株抗菌效果的影響 通氣量是影響微生物菌體生長和代謝的重要因素，所以裝瓶量也會影響菌株的抗菌效果，250mL的三角瓶裝量分別為50、75、100、125、150mL進行發(fā)酵培養(yǎng)實驗，結果如圖6所示，裝瓶量為100mL時，其抗菌活性最大。

圖6 不同裝瓶量對FL10菌株抗菌效果的影響

3 討論與結論

作為一類重要的生防細菌，熒光假單胞菌能產生多種活性物質，拮抗多種植物病害，其作用機制包括：抗生素的作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖等[10-12]。另外熒光假單胞菌生化能力活躍，可降解許多環(huán)境污染物如亞硝酸鹽等[13-14]，因而也常被用于環(huán)境保護。本研究所篩選到的熒光假單胞菌FL10來自海洋生境，對常見的水產病原菌表現(xiàn)出較強的拮抗作用，顯示了不同分布來源（陸地生境、海洋生境）的熒光假單胞菌屬共同的生防特性，但其拮抗機理是否與陸源相似尚不得而知，需做進一步研究。

結論：本研究從海水對蝦養(yǎng)殖池水中篩選到一株對部分水產養(yǎng)殖病原菌具有抗菌活性的生防細菌FL10，通過對FL10進行一系列的理化實驗和16S rDNA同源性分析，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，鑒定此菌株為熒光假單胞菌。通過對其發(fā)酵條件進行初步的研究確定最佳發(fā)酵條件如下：KB培養(yǎng)基（蛋白胨20g，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO4 1.5g，甘油10mL，水1000mL），發(fā)酵控制溫度30℃，發(fā)酵起始pH值調整為7，發(fā)酵時間控制在36h，接種量5%，250mL的三角瓶裝量為100mL。通過對其發(fā)酵條件的優(yōu)化，為以后規(guī)?；a以及菌株的開發(fā)應用進行了有益的探索。

參考文獻

[1]楊合同，王少杰，許勃.熒光假單胞菌與植物病害生物防治[J].山東科學，1993，6（3）：50-56.

[2]羅鵬，許煜泉，陳峰.熒光假單胞菌株M18產吩嗪—1—羧酸的條件[J].上海交通大學學報，2003，37（5）：650-653.

[3]雷陽，曾延松.熒光假單胞菌的生物防治機理[J].貴州農業(yè)科學，2002，30（5）：46-47.

[4]張繼英，張婭婷，邱立友.熒光假單胞菌對食用菌生長的促進作用研究[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2013（2）：71-74.

[5]Haas D，Blutner C，Keel C.Biocontrol ability of Fluorescent pseudomonadsgenetically dissected：importance of positive feedback regulation[J].Current Opinion in Biotechnology.2000（11）：290-297.

[6]王燦華，祝新德，許煜泉，等.假單胞菌株M18分泌羧基吩嗪抑制黃瓜枯萎病害[J].上海交通大學學報，2000，34（11）：1574-1578.

[7]Tagg JR，McGiven AR.Assay systems for bacteriocins[J].Applied Microbio，1971：l21-125.

[8]徐長安，羅秀針，張怡評，等.一株海洋芽孢桿菌B09的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].海洋通報，2009，28（5）：74-78.

[9] RE.布欽南，NE.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊（第8版）[M].北京；科學出版社，1984.

[10]張偉瓊，聶明，肖明.熒光假單胞菌生防機理的研究進展[J].生物學雜志，2007，24（3）：9-11，24.

[11]趙翔，陳紹興，謝志雄，等.高產鐵載體熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens sp-f的篩選鑒定及其鐵載體特性研究[J].微生物學報，2006，46（4）：516-521.

[12]周洪友.熒光假單胞菌2P24抗生素2，4-二乙?；g苯三酚生物合成的基因調控研究[D].北京：中國農業(yè)大學，2005.

[13]陳瑞芳，徐長安，劉麗梅，等.一株假單胞菌的亞硝酸鹽降解特性及其對魚池底泥的凈化作用[J]. 海洋科學，2011，35（6）：30-34.

[14]羅秀針，徐長安，唐旭，等.反硝化細菌的篩選及其亞硝酸鹽降解特性研究[J].福建農業(yè)學報，2010，25（4）：513-516.

（責編：陶學軍）