DNS法測(cè)定植物組織中還原糖及總糖含量實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

摘 要：針對(duì)現(xiàn)有生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)“DNS法測(cè)定植物組織中還原糖及總糖含量”中的一些不足進(jìn)行改進(jìn)，包括實(shí)驗(yàn)材料選擇、波長(zhǎng)選擇、DNS量、顯色時(shí)間、DNS的配制等方面，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)中一些注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳細(xì)分析，以提高該實(shí)驗(yàn)的教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：DNS法；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；還原糖；改進(jìn)

中圖分類號(hào) Q547 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-7731（2013）11-16-02

3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）是在堿性條件下，DNS與還原糖加熱后被還原成橘紅色氨基化合物，然后比色測(cè)定糖含量。該法可測(cè)定還原糖和總糖含量，并可通過(guò)多糖=總糖-還原糖，粗略獲得多糖含量。相比之下，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、雜質(zhì)干擾較小等優(yōu)點(diǎn)[1-9]。

“DNS法測(cè)定植物組織中還原糖及總糖含量”實(shí)驗(yàn)涉及了一些基本的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能，如組織搗碎（或研磨）、離心技術(shù)、定容操作、比色測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等。該實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行岣邔W(xué)生的基本操作技能和動(dòng)手能力，同時(shí)能將理論知識(shí)與實(shí)際應(yīng)用很好地結(jié)合在一起。實(shí)驗(yàn)的學(xué)時(shí)及難度適中，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中是一項(xiàng)很好的綜合性實(shí)驗(yàn)。

筆者根據(jù)多年來(lái)實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，現(xiàn)對(duì)該實(shí)驗(yàn)相關(guān)步驟進(jìn)行改進(jìn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)中值得注意的地方進(jìn)行詳細(xì)總結(jié)，以提高其教學(xué)效果。

1 方法改進(jìn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料選擇 多數(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中的該實(shí)驗(yàn)對(duì)象為淀粉[1-5]。淀粉作為實(shí)驗(yàn)材料的缺點(diǎn)主要有：（1）還原糖含量一般很低（如紅薯淀粉）；（2）不同淀粉的還原糖含量也不一樣；（3）材料本身缺乏可操作性等。本著材料來(lái)源容易，還原糖含量高，色素影響小，易提取，能有效提高學(xué)生的動(dòng)手能力和激發(fā)實(shí)驗(yàn)興趣，理論與實(shí)際應(yīng)用有效結(jié)合等各方面的因素，結(jié)合多年來(lái)的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累，認(rèn)為白薯（又名“地瓜”）為最佳實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 波長(zhǎng)選擇 考慮到DNS顯色液的影響、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性和最大吸收值等相關(guān)因素[6，10-11]，多年來(lái)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)結(jié)果證明520nm為最適測(cè)定波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要提醒學(xué)生，比色測(cè)定時(shí)首先要準(zhǔn)確調(diào)好波長(zhǎng)，在測(cè)量時(shí)就不能再調(diào)了，更不能更換分光光度計(jì)。

1.3 DNS添加量 DNS的量與待測(cè)液中還原糖的含量有關(guān)。DNS過(guò)多會(huì)使其吸光度增大，從而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系[10]。實(shí)驗(yàn)證明，添加3mL的DNS較適宜，還原糖含量與吸光值之間的線性較好。

1.4 顯色時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)證明，顯色5min以上，其吸光值已基本趨于穩(wěn)定[10-11]?？紤]到教學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)水浴溫度未達(dá)到或接近沸水浴等因素，故建議顯色時(shí)間設(shè)定為6～8min。實(shí)驗(yàn)中所有水浴對(duì)象的沸水浴時(shí)間要保持統(tǒng)一。

1.5 DNS試劑的配制 DNS試劑中酒石酸鉀鈉的作用是防止溶解氧的侵入（DNS與還原糖反應(yīng)是一種氧化還原反應(yīng)，隨著氧在待測(cè)液中溶解量的增加，顯色液的吸光值呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)）；苯酚是增加DNS顯色后的顏色深度，以及平衡脲形成時(shí)對(duì)糖測(cè)定的影響；亞硫酸氫鈉與苯酚配合使顯色后顏色更加穩(wěn)定；堿性環(huán)境是DNS與還原糖顯色作用的條件[10]。

配制方法：把DNS加入到氫氧化鈉溶液中，（下轉(zhuǎn)26頁(yè)）（上接16頁(yè)）加熱攪拌待其完全溶解后，加入已溶解的酒石酸鉀鈉溶液并混勻，再加入苯酚和亞硫酸氫鈉，貯存于棕色試劑瓶中。

2 注意事項(xiàng)分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一些細(xì)節(jié)問(wèn)題值得注意，如：（1）現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)室條件都普遍提高了，可以考慮選擇組織搗碎機(jī)或勻漿機(jī)代替手工研磨實(shí)驗(yàn)材料，這樣可以從很大程度上減少實(shí)驗(yàn)誤差；（2）除去提取的糖溶液中雜質(zhì)可采用4 000r/min，離心5min；（3）比色皿要使用同一廠家生產(chǎn)的且為同一型號(hào)的，比色皿的清潔度無(wú)疑是實(shí)驗(yàn)誤差的主要因素，比色皿的清洗可以先用小鑷子夾酒精棉球里外擦凈，然后再用蒸餾水里外沖洗3遍。（4）控制好待測(cè)液吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)，濃度過(guò)高要進(jìn)行稀釋；（5）比色測(cè)定前需自然冷卻至室溫，切勿驟冷而導(dǎo)致溶液渾濁，同時(shí)，測(cè)定時(shí)溶液要混勻；（6）因多糖水解成單糖時(shí)，每斷裂1個(gè)糖苷鍵需加入1個(gè)水分子，故在計(jì)算總糖含量時(shí)，需將測(cè)得的單糖量乘以0.9加以校正；（7）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意DNS的污染。

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（責(zé)編：徐世紅）