頭花蓼愈傷組織誘導(dǎo)及分化

摘要：研究了2種外植體（葉片、莖段）、消毒方法、培養(yǎng)基種類、活性炭、植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對頭花蓼愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響。結(jié)果表明，最佳消毒方法為以0.15%HgCl2消毒葉片6min和10%NaClO消毒莖段9min；不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生率依次為MS>1/2MS>B5；MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L有利于愈傷組織形成；MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L有利于愈傷組織增殖；MS+6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L有利分化，分化率為83.33%，產(chǎn)生不定芽平均數(shù)為5.1個。培養(yǎng)基中附加100mg/L活性炭，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。

關(guān)鍵詞：頭花蓼；葉片；莖段；愈傷組織

中圖分類號 S58 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）17-21-04

花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don）別名四季紅、銅礦草、石辣蓼、石莽草等，屬蓼科蓼屬多年生草本植物，我國主要分布于西藏、廣東、四川、湖北、廣西、云南、貴州等省區(qū)，印度、越南也有生長，其中在我國有17種、7變種，資源十分豐富。頭花蓼是一種理想的彩葉花卉植物[1]，具有較高的觀賞價值，可作為垂直綠化、邊坡護理、地被綠化和觀花等的良好材料推廣應(yīng)用[2]；也是一種重金屬耐受植物，在廢棄地的植物重建、修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用價值；同時頭花蓼全草均可入藥，有清熱解毒、祛風止痛、去腐生肌的作用[3-4]。

頭花蓼需求量大且野生資源有限，快速繁育體系可以有效解決原料供應(yīng)不足的問題。頭花蓼組織培養(yǎng)方面，尤其是愈傷組織培育研究較少。毛堂芬[5]和龍祥友[6]分別以頭花蓼帶節(jié)莖段、莖尖為外植體進行組培快速繁殖。筆者以頭花蓼的葉片、莖段為外植體，通過組織培養(yǎng)手段建立無菌培養(yǎng)體系，研究了不同類型外植體、消毒方法、培養(yǎng)基類型、活性炭、植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對其愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為頭花蓼愈傷組織的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料頭花蓼采自重慶北碚縉云山，后栽植于西南大學園藝園林學院園林植物與栽培育種實驗室，進行常規(guī)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種外植體的最佳消毒方法篩選 摘取頭花蓼剛展開葉片和不帶芽莖，在流水下沖洗1h，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次。在超凈工作臺上，先用75%酒精進行表面消毒處理10～20s，分組后分別用0.15%HgCl2溶液浸泡2、4、6、8、10min，以及10%NaClO浸泡3、6、9、12min。外植體消毒后，用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，用無菌刀將葉片切成0.3cm2的小塊，莖段切成1cm左右的小段，在無菌的條件下接種在無激素的MS培養(yǎng)基中。每瓶接種3個外植體，接種10瓶，每組設(shè)3次重復(fù)。每3d記錄外植體污染數(shù)和存活數(shù)一次，以30d為周期統(tǒng)計其污染率和死亡率。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

1.2.2.1 3種培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 取已建立的無菌體系苗，將切取好的葉片、莖段分別接種于含有6-BA1.0mg/L，NAA0.3mg/L的MS、1/2MS、B5的3種培養(yǎng)基上。

1.2.2.2 6-BA與NAA組合對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 選擇以上最佳培養(yǎng)基，分別以6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L，NAA 0.3、0.5mg/L為外源激素采取兩因素完全隨機組合設(shè)計。每瓶接種3個外植體，接種10瓶，每組設(shè)3次重復(fù)。每3d觀察記錄一次，以30d為周期，統(tǒng)計不同外植體愈傷組織及生長狀況。

1.2.3 愈傷組織增殖 無菌條件下，選取頭花蓼生長旺盛的胚性愈傷組織，切取直徑大小約為0.3cm的塊接種于MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基附加外源激素6-BA 0、2.0、4.0mg/L，NAA 0.2mg/L。90d（期間繼代2次）后，稱取愈傷組織的重量，在80℃下進行烘干，測得干物質(zhì)含量。

1.2.4 愈傷組織分化

1.2.4.1 活性炭對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 分別添加0、100、500mg/L活性炭，在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，觀察并記錄活性炭對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.4.2 不同濃度6-BA對不定芽誘導(dǎo)的影響 無菌條件下，將增殖的愈傷組織取出切成直徑大小約為0.5cm的塊，分別轉(zhuǎn)接到含有6-BA 0、2.0、4.0、6、8、10mg/L，IBA 0.1mg/L培養(yǎng)基上。

1.2.5 培養(yǎng)條件 除基本培養(yǎng)基和激素濃度篩選試驗外，培養(yǎng)基均采用MS固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH值為5.8，于121℃高溫下滅菌20min。在光照強度1 600lx下光照16h/d，培養(yǎng)溫度25℃。

1.2.6 統(tǒng)計指標 外植體污染率（%）=（外植體污染數(shù)/外植體接種數(shù)）×100

外植體死亡率（%）=（外植體死亡數(shù)/外植體接種數(shù)）×100

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100

分化率（%）=（形成不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)）×100

平均芽數(shù)=產(chǎn)生芽數(shù)/產(chǎn)生芽的愈傷組織數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 2種外植體的最佳消毒方法篩選 由表1可知，對于0.15%HgCl2處理的葉片，消毒4～6min時，污染率急劇下降，消毒10min以后沒有污染，消毒效果較好；消毒6～8min時，葉片死亡率增加明顯，10min時葉片全部死亡。0.15%HgCl2處理莖段，消毒8min以后沒有污染；消毒8～10min時，死亡率增加明顯，10min時為98%。以10%NaClO處理2種外植體，經(jīng)過實驗分析也出現(xiàn)以上相似趨勢。說明，采用0.15%HgCl2和10%NaClO處理頭花蓼葉片和莖段2種外植體時，隨處理時間的增加，其污染數(shù)目逐漸減少，污染率在降低；其存活數(shù)目逐漸減少，死亡率在增加。綜合分析，在頭花蓼愈傷組織培養(yǎng)過程中從外植體材料的低污染率和高成活率來考慮，最佳消毒方法為：以0.15%HgCl2處理葉片消毒6min，污染率為16.67%，死亡率為19%；以10%NaClO處理莖段消毒9min，污染率和死亡率均為13.33%。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

2.2.1 3種培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表2可知，同一培養(yǎng)基條件下，葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)率普遍低于莖段愈傷組織誘導(dǎo)率，表明采用莖段作為外植體誘導(dǎo)愈傷效果較好。觀察發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基中的愈傷組織多呈紅褐色，少帶綠色，其中MS培養(yǎng)基中愈傷組織生長狀況較好，且有少量芽點出現(xiàn)。在同等激素濃度下，頭花蓼2種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率最高的為MS培養(yǎng)基，葉片和莖段誘導(dǎo)率分別為74%和82%；1/2MS培養(yǎng)基次之；最低為B5培養(yǎng)基。

2.2.2 6-BA與NAA組合對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表3可知，在以上最佳培養(yǎng)基（MS）中，添加不同濃度的6-BA和NAA配比，結(jié)果表明：在NAA濃度相同條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA濃度增加逐漸上升，但當激素濃度超過最適數(shù)值時，愈傷組織誘導(dǎo)率有所下降。說明低濃度的6-BA處理有利于愈傷組織誘導(dǎo)，而高濃度又會抑制愈傷組織形成。NAA濃度隨6-BA濃度的變化，也出現(xiàn)以上類似規(guī)律。愈傷組織誘導(dǎo)中，適宜濃度6-BA和NAA共同作用將有利于植物細胞脫分化，愈傷組織誘導(dǎo)率較高。編號2培養(yǎng)基中，葉片、莖段2種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分別為73.33%和86.67%，最佳配比濃度為6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L。編號1、6培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最差。

2.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)觀察 觀察發(fā)現(xiàn)，不同編號培養(yǎng)基對頭花蓼外植體愈傷組織的誘導(dǎo)存在較大差異。葉片和莖段在接種7d左右，基部稍有膨大，傷口處開始變成紅褐色，產(chǎn)生極少量愈傷組織。接種28d后，外植體顏色加深，呈現(xiàn)出紅褐色，切口變皺，愈傷組織顯著膨大。愈傷組織的形成過程受植物外植體種類、培養(yǎng)基種類及成分和培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，合適的條件有利于愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立。

2.3 愈傷組織增殖 由表4可知，將愈傷組織接種到不同濃度6-BA的增殖培養(yǎng)基中，只添加NAA時，愈傷組織分化出根，不表現(xiàn)出生長；同時添加6-BA和NAA，愈傷組織表現(xiàn)出分化和生長狀態(tài)。當NAA濃度為0.2mg/L不變時，愈傷組織數(shù)量隨6-BA濃度增加呈現(xiàn)增加趨勢，由26.7%增加到86.2%，愈傷組織生長強于分化，生長趨于正常。說明僅有NAA時，有利愈傷組織分化，分化出氣生根；6-BA與NAA提高到合適濃度時，有利于愈傷組織增殖。最佳增殖濃度配比為6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L，增加率為86.2%，愈傷組織生長正常。

2.4 愈傷組織分化

2.4.1 活性炭對愈傷組織分化的影響 由表5可知，培養(yǎng)基中添加活性炭對頭花蓼愈傷組織褐化起抑制作用，愈傷組織褐變率隨活性炭濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高趨勢。未添加活性炭時，褐化率為35.20%，且褐化出現(xiàn)在切口周圍，程度嚴重；加100mg/L活性炭時，褐化率為6.8%，且褐化現(xiàn)象出現(xiàn)較少，并且程度較輕；加500mg/L活性炭時，褐化率為13.30%，褐化較嚴重，部分出現(xiàn)枯萎。說明活性炭對頭花蓼愈傷組織的褐變有一定的抑制作用，須選擇適宜的濃度。結(jié)果表明，加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。

2.4.2 不同濃度6-BA對不定芽誘導(dǎo)的影響 由表6可知，培養(yǎng)基中6-BA和IBA配合添加將有利于愈傷組織不定芽分化。觀察發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度過低，愈傷組織會出現(xiàn)不定根；濃度過高時愈傷組織會褐化。IBA濃度在0.1mg/L時，隨著6-BA濃度增加，不定芽分化指數(shù)呈現(xiàn)升高趨勢。當6-BA濃度為8mg/L時，不定芽分化率最高，為83.33%；6-BA 6mg/L、10mg/L時，不定芽分化率次之，分別為63.33%和66.67%；6-BA 2mg/L時最低，分化率為16.67%。6-BA 6mg/L和8mg/L時，愈傷組織分化成不定芽的平均數(shù)最高，分別為5.2個和5.1個；其次為6-BA 10mg/L，愈傷組織分化成不定芽的平均數(shù)為4.6個。綜合考慮，頭花蓼愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳配合比為：6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率為83.33%，不定芽平均數(shù)為5.1個。

3 結(jié)論

頭花蓼外植體來源廣泛，能作為材料長期用于誘導(dǎo)建立愈傷組織無性系。最佳消毒方法為0.15%HgCl2處理葉片消毒6min；10%NaClO處理莖段消毒9min，且以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織較葉片效果更好。

材料自身差異導(dǎo)致培養(yǎng)條件存在略微不同。實驗發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，這與蔡能[7]報道相一致。在MS中添加6-BA 1.0mg/L、NAA 0.3mg/L有利于形成愈（下轉(zhuǎn)55頁）（上接23頁）傷組織，同時發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 4mg/L+ NAA 0.2mg/L為最佳增殖配合比。

活性炭對頭花蓼愈傷組織的褐變有一定的抑制作用[8]。附加100mg/L活性炭效果最佳，褐化率僅為6.80%，愈傷組織生長和分化效果較好。以6-BA和IBA為激素配比，發(fā)現(xiàn)頭花蓼愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳配合比為6-BA 8mg/L+IBA 0.1mg/L，分化率為83.33%，不定芽平均數(shù)為5.1個。

參考文獻

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[8]劉用生，李有勇.植物組織培養(yǎng)中活性炭的使用[J].植物生理學通訊，1994，30（3）：214-217. （責編：徐世紅）