銀耳多糖的分子修飾及抗氧化作用的研究

摘要：用POCl3修飾酸水解銀耳多糖所產(chǎn)生的單糖或低聚糖，并通過紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)修飾后的產(chǎn)物含有磷酸基團(tuán)；此外，通過鄰苯三酚自氧化法，結(jié)合紫外光譜分析，對修飾前后產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明：在常溫中性條件下，POCl3用量4%～5%，反應(yīng)時間20～35min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液只剩20～30mL時，可以使銀耳多糖酸解出的產(chǎn)物充分磷酸化，且磷酸化修飾后產(chǎn)物的抗氧化作用有較明顯的提高。

關(guān)鍵詞：銀耳多糖；酸水解；分子修飾；三氯氧磷；抗氧化

中圖分類號 TQ464.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）17-17-03

分子修飾是通過化學(xué)、物理學(xué)及生物學(xué)等手段對化合物分子進(jìn)行改造，以獲得性能更加優(yōu)良的結(jié)構(gòu)類似衍生物的方法[1]。分子修飾可改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置和生物活性，是多糖構(gòu)效關(guān)系及其藥物研究的有效手段；而構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果又指導(dǎo)著多糖分子修飾的方向，可分析多糖結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系，為其藥物設(shè)計、研究和開發(fā)提供理論支持[2-3]。選擇合適的方法對多糖進(jìn)行分子修飾，可提高其生物活性或降低其毒副作用。為提高多糖活性，多糖分子修飾研究已有很大進(jìn)展。將多糖或寡糖進(jìn)行衍生化，如降解、硫酸化、磺?；?、乙?；⑼榛?，對提高銀耳多糖的水溶性、抗病毒活性或提高免疫力等功能具有良好的作用[4]。

銀耳（Tremella fuciformis Berk），屬菌類植物，素有“菌中之冠”美稱，又名白木耳，是一種高等真菌，具有滋陰潤肺、益氣和血、補(bǔ)腎益精、強(qiáng)心健腦的功能。

銀耳營養(yǎng)成分齊全，賴氨酸含量豐富，碳水化合物含量為65%～78.3%，其中銀耳多糖就占了干重的60%以上，銀耳多糖可提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫功能，抑制腫瘤發(fā)生；銀耳富含疏、磷、鐵、鎂、鉀、鈉及多種元素，對平衡人體代謝十分有益；銀耳含脂類較少，且多為磷脂，因而對高血脂、高血壓及動脈硬化患者有益；銀耳中的粗纖維含量為2.4%～2.75%，對老年便秘患者相當(dāng)有利；銀耳還含有多種B族維生素，如硫胺素、核黃素等。

近年來，對銀耳的化學(xué)成分及藥理活性進(jìn)行的許多研究和大量的現(xiàn)代藥理證明，多數(shù)藥理活性都與銀耳多糖有關(guān)。從銀耳子實(shí)體中分離到的多糖，相對分子質(zhì)量1.15×105，由巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成，總糖含量為75.7%，含葡萄糖醛酸14.7%。

通常把較高分子量的多糖，降解成較低的分子量，能顯著提高其活性。選擇適當(dāng)?shù)慕到夥椒?，將多糖降解到適宜的分子量，至關(guān)重要。目前降解多糖的方法主要有酸降解、酶降解和超聲波降解等[5]。

本實(shí)驗對酸水解后的銀耳單糖或低聚糖用POCl3[6]進(jìn)行分子修飾，以期改變其分子結(jié)構(gòu)，增加磷酸基功能團(tuán)，達(dá)到提高生物活性的目的。

1 原理和方法

銀耳多糖是活性多糖中的雜多糖，是大分子，可以先將銀耳多糖降解成小分子物質(zhì)，再進(jìn)行分子改造。

1.1 銀耳多糖的酸解 酸降解的依據(jù)是，酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖降解為低分子片段，控制酸濃度、溫度及時間可獲得不同分子量大小的降解產(chǎn)物。

1.2 銀耳多糖酸解產(chǎn)品磷酸化反應(yīng)機(jī)理 將銀耳多糖降解，得到以甘露糖為主的單糖或者低聚糖，然后用POCl3在適當(dāng)?shù)膒H、用量和反應(yīng)時間下，充分和銀耳多糖的降解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，生成具有磷酸基團(tuán)的新產(chǎn)物，從而提高降解物質(zhì)的抗氧化活性，增加其用途。

1.3 銀耳多糖酸解產(chǎn)品的制備 先粉碎銀耳，稱量50g銀耳粉置于900mL的燒杯里；再稱量800mL蒸餾水加入900mL燒杯中，攪拌溶解燒杯內(nèi)的銀耳粉；接著移取占蒸餾水量20%的濃HCl，混勻攪拌，蓋上保鮮紙；然后立即水浴，設(shè)定80℃，2h水?。蝗〕龊?，立即用氫氧化納固體中和溶液中的鹽酸至pH為7；然后，將溶液過濾，棄渣取液，放入冰箱保存。

1.4 銀耳多糖酸解產(chǎn)品改性實(shí)驗方法 先在溶液中加入適量的活性炭，將液體煮沸，自然冷卻，接著抽濾，使之脫色；取無色透明液體300mL，均分為3個250mL燒杯裝，其中2個加入不同量的POCl3，按液體4%～5%取量，然后加入每個250mL燒杯中，讓其反應(yīng)20～35min；反應(yīng)完后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將每個小燒杯的水分蒸出，將每間隔一段時間蒸出的氯化鈉結(jié)晶取出收集起來，另外烘干，取燒杯內(nèi)的液體繼續(xù)蒸，直至得到修飾后較純產(chǎn)品，設(shè)定旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為70℃；將產(chǎn)物制成丸粒完全烘干或半烘干。

1.5 銀耳多糖酸解產(chǎn)品改性前后分子結(jié)構(gòu)的測定方法 采用紅外光譜法，稱取經(jīng)過充分干燥的三氯氧磷化后的銀耳多糖酸解產(chǎn)物10mg，KBr壓片測定其紅外光譜。從中分析修飾之后和修飾之前產(chǎn)物的基團(tuán)差異，尋找磷酸基團(tuán)的存在。

1.6 銀耳多糖酸解產(chǎn)品改性前后活性的測定方法 采用鄰苯三酚自氧化法[7]。取4.5mL 0.1mol/L的Tris—HCl緩沖液，依次加入1.0mL乙二胺四乙酸鈉溶液，1.0mL樣品溶液，2.4mL水，混勻，于25℃水浴反應(yīng)10min，再加入100μL 9mmol/L鄰苯二酚，加入時計時，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)60min后，加入50μL 12mol/L HCl溶液，終止反應(yīng)，立即在325nm處測定吸光度值A(chǔ)S?？瞻坠芤?.0mL蒸餾水代替1mL樣品，操作方法同樣品管，可測得空白管的吸光度AC。

清除率（%）=（AC—AS）/AC×100

式中：AS——含有待測物的反應(yīng)液于325nm處的吸光度值；AC——不含有待測物的反應(yīng)液于325nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖酸解方法的研究 本實(shí)驗通過在80℃水溫，2h、3h、4h的水浴時間下，將銀耳粉和鹽酸充分反應(yīng)得到較純的銀耳多糖的分解產(chǎn)物，通過得率的比較，發(fā)現(xiàn)在80℃，2h的情況下，銀耳多糖分解產(chǎn)物的得率最高。

2.2 改性方法的研究與反應(yīng)工藝的確定 通過田龍、劉亞偉[8]對三氯氧磷交聯(lián)木薯淀粉研究的啟示，探索實(shí)驗方法，對三氯氧磷安全用量進(jìn)行了分析，最后發(fā)現(xiàn)在常溫中性條件下，POCl3添加量占溶液體積的4%～5%，POCl3和銀耳多糖酸降解產(chǎn)物的反應(yīng)時間20～35min時，產(chǎn)物的三氯氧磷磷酸化的效果較好，得到了修飾后的產(chǎn)物的紅外圖譜，圖形基本重合。在常溫中性，35min的反應(yīng)時間，4.8mL和5mL三氯氧磷量的條件下，修飾銀耳多糖降解產(chǎn)品，得到了較大量的具有磷酸基團(tuán)并具有抗氧化活性的產(chǎn)品，當(dāng)溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)最后剩余20～30mL時烘干制得產(chǎn)品，抽樣檢測為同一改性產(chǎn)品。由此，最終確定了改性的方法和工藝流程[8-11]。

另外，本實(shí)驗還進(jìn)行了降解后銀耳單糖或低聚糖溶液pH調(diào)節(jié)的探索，發(fā)現(xiàn)應(yīng)取pH7的條件。

本實(shí)驗在脫色、棄渣取液以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過程中除去較多的雜質(zhì)，以盡可能得到較純的產(chǎn)品。

2.3 修飾后產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)的測定

2.3.1 紅外光譜圖的測定 上曲線1為銀耳多糖降解產(chǎn)物的紅外光譜圖，下曲線2是銀耳多糖降解產(chǎn)物經(jīng)過三氯氧磷改性后的紅外光譜圖。1和2比較，相同的功能團(tuán)是3 721.26cm-1的峰為0-H的吸收峰；3 375.35cm-1的寬峰為0-H和N-H的伸縮振動，2 939.96cm-1為C-H的吸收峰，兩峰是糖類的特征吸收峰；1 606.46cm-1的峰為-CHO的吸收峰；1 416.60cm-1的峰是-COOH的吸收峰，670.49cm-1的吸收峰分別對應(yīng)圖2的3 727.88、3 367.61、2 946.17cm-1和2 891.91、2 361.19cm-1和2 337.50、1 647.97、1 736.46、671.45cm-1和651.97cm-1的吸收峰[12]。

不同之處是1在852.02cm-1附近（包括789.92cm-1）處都有吸收，說明銀耳多糖降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中存在著α型糖苷鍵（即α端基差向異構(gòu)體），而2則是有磷酸基功能團(tuán)。通過這2張相似的紅外光譜圖的對比，我們可以發(fā)現(xiàn)這2種物質(zhì)是為改性前后的物質(zhì)，2比1增加了磷酸基官能團(tuán)，有些物質(zhì)的含量有所增減。由于銀耳多糖是一種雜多糖，其酸降解后的產(chǎn)物是由多種單糖組成的[13]，上曲線和下曲線是由多種單糖構(gòu)成的混合物的修飾前和修飾后的產(chǎn)物，并不是甘露糖的修飾前和修飾后的產(chǎn)物，因此，修飾前的產(chǎn)物具有甘露糖所沒有的功能團(tuán)。

2.3.2 銀耳多糖酸解產(chǎn)品改性前后的紅外圖譜比較分析 通過曲線1和2的比較，可以從圖1看出，將三氯氧磷化的銀耳多糖酸解產(chǎn)品的紅外光譜和銀耳多糖酸解產(chǎn)品的紅外光譜相比較，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖酸解產(chǎn)品經(jīng)三氯磷酸化后，在1 059.62cm-1（v-C-O-C-）處連接上了一個磷酸基團(tuán)，在1 135.81cm-1和984.06cm-1處組成一個磷酸雙峰；在1 135.81cm-1處，磷酸基團(tuán)雙峰之一受1 059.62cm-1（v-C-O-C-）處的修飾前的-C-O-C-六元環(huán)和右側(cè)糖甘鍵基團(tuán)的拉動發(fā)生了少許偏移，磷酸雙峰與圖1原有基團(tuán)彼此相互作用形成了一個大的吸收峰[14]。其中官能團(tuán)相似的圖譜之所以沒有重合，可能是由于POCl3的作用。

圖1 修飾前后產(chǎn)品比較

從上面的分析，可以看出，1比2多了個α型糖苷鍵，2則比1多了個磷酸基團(tuán)。經(jīng)多次產(chǎn)品紅外分析，圖譜重現(xiàn)性高。

2.4 修飾后產(chǎn)物抗氧化性的測定 本實(shí)驗利用O-2清除劑能使鄰苯三酚自氧化[15]產(chǎn)物在325nm處的吸收峰受到抑制這一特點(diǎn)，進(jìn)行光化學(xué)方法測定。

由清除率的計算公式可以計算出修飾前后產(chǎn)物的清除作用的大小，通過比較可以發(fā)現(xiàn)4.8mL和5mL三氯氧磷用量的修飾后的產(chǎn)物的抗氧化活性明顯高于修飾前的產(chǎn)物的抗氧化活性。表明修飾成功，具有實(shí)用意義。由表1可知，當(dāng)三氯氧磷的用量為4.8mL時，其清除率比5mL時的要高，可能是因為當(dāng)三氯氧磷過量時，多余三氯氧磷會繼續(xù)與三氯氧磷化后的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，使其變?yōu)榱硪环N物質(zhì)，導(dǎo)致一些含有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)變成沒有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)，而降低清除率。 （下轉(zhuǎn)38頁）

表1 修飾前后產(chǎn)物的清除作用比較

[POCL3（mL）＼摩爾濃度（mol/L）＼清除率（%）＼0＼1＼36.36＼4.8＼2＼68.18＼5＼3＼54.54＼]

通過以上的比較分析，可以證明銀耳多糖酸解產(chǎn)品經(jīng)三氯磷酸化后，增加了磷酸基團(tuán)，抗氧化活性有了較大的提高[13]。經(jīng)多次實(shí)驗，產(chǎn)品的抗氧化性能均較好。

通過紅外圖譜分析和抗氧化的研究結(jié)果分析，可以得出如下結(jié)論，使產(chǎn)品具有抗氧化功能的基團(tuán)是磷酸基團(tuán)，而并不是其他功能團(tuán)。

3 結(jié)論

3.1 酸降解銀耳多糖的最佳條件 本實(shí)驗表明酸降解產(chǎn)生單糖或低聚糖在80℃、2h水浴，鹽酸濃度約15.8%的條件下，銀耳多糖的得率最高。

3.2 銀耳多糖酸降解產(chǎn)品的POCl3化方法 通過實(shí)驗可以得出：在常溫中性條件下，POCl3用量4%～5%，反應(yīng)時間20～35min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液只剩20～30mL時，得到銀耳多糖酸解出的產(chǎn)品都具有磷酸基團(tuán)。

3.3 銀耳多糖酸降解產(chǎn)品的抗氧化性 本實(shí)驗通過鄰苯三酚自氧化法對磷酸化修飾后產(chǎn)物的抗氧化作用進(jìn)行了研究，通過清除率的分析發(fā)現(xiàn)，修飾后產(chǎn)物的抗氧化作用較修飾前有較明顯的提高。

4 展望

本實(shí)驗是通過銀耳多糖降解產(chǎn)品在修飾前和修飾后的基團(tuán)的變化情況，來判斷出有無修飾上磷酸基團(tuán)的。如果能夠得到它的完全純化樣品，則可通過質(zhì)譜分析，得出其分子式，結(jié)合紅外光譜解析的計算方法，得出飽和度，從而用于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的判斷。

通過實(shí)驗，我們看到銀耳多糖修飾后的產(chǎn)物具有良好的抗氧化性，在生命科學(xué)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，對于藥物、保健品的開發(fā)具有積極的意義。

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