山羊SPRN基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

摘要：以山羊小腦cDNA為模板，利用RT-PCR法擴(kuò)增獲得了SPRN基因完整編碼區(qū)片段，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109后，篩選并鑒定陽性克隆，通過序列測量，將序列正確的片段雙酶切后連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1上。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的真核表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：山羊；SPRN基因；RT-PCR；真核表達(dá)載體

中圖分類號：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5618-03

SPRN基因編碼Shadoo（簡稱Sho）蛋白，在結(jié)構(gòu)上與PrPc類似。Sho蛋白約包括130～150個氨基酸，N端保守，含有最多6個富含Arg的四肽XXRG（X是G、A或S）重復(fù)的堿性區(qū)域和約20個AA與PrPc有非常高同源性的疏水區(qū)。與N端相比，C端不夠保守，與PrP差異較大，包含一個糖基化位點(diǎn)，末端是GPI錨的信號肽。Sho蛋白氨基酸在不同物種中差異不大[1]。

Sho蛋白具有與PrPc相似的神經(jīng)保護(hù)作用，因此認(rèn)為SPRN基因是一個與TSEs有關(guān)的一個候選基因[2]。2007年8月發(fā)現(xiàn)了稱為‘Shadoo’的朊病毒蛋白，證明了這種理論上的病毒蛋白真正存在，同時也觀測到了這種病毒在朊病毒傳染病過程中的意外改變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Shadoo蛋白具有類似于PrPc的保護(hù)性，降低了朊蛋白感染的水平[3]。這一發(fā)現(xiàn)可能會對于朊病毒蛋白的功能，朊病毒如何在動物之間進(jìn)行傳播，以及如何導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡等問題的研究提供新的思路。SPRN基因在小鼠、綿羊、倉鼠、人、大鼠和牛腦組織轉(zhuǎn)錄水平高，在其他組織中也檢測到表達(dá)[4-10]。本研究以小腦組織作為試驗(yàn)材料擴(kuò)增構(gòu)建了山羊SPRN基因的真核表達(dá)載體，為研究該基因的表達(dá)定位、抗體制備以及蛋白的功能提供了必要的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶、引物合成與測序、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Trizol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、GC Buffer Ⅱ、dNTPs購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山羊小腦組織總RNA的提取 RNA的提取按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 特異性引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中山羊SPRN基因的序列，利用Prime Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并在正向引物引入限制性Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)5′-GAAGATCTGAGGTCTCCTCCGTCCT-3′，在反向引物引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)5′-CGGAATTCCACAGGCCTACCGCA-3′。

1.2.3 山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增

1）cDNA第一鏈的合成。以提取的山羊小腦組織總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈合成：配制模板RNA 10 μL，oligo（dT）18 primer 5.00 μL，RNase free dH2O 15 μL的混合液；70 ℃保溫10 min，冰浴2 min。短暫離心后分別加入10 μL 5×M-MLV Buffer，2.50 μL 10 mmol/L dNTP Mixture，1.25 μL Recombinant Ribonuclease Inhibitor，1.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV和5.00 μL RNase free dH2O；42 ℃ 60 min，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻。所得產(chǎn)物直接用于PCR。

2）PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，含10×LA PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向和反向引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板 1 μL，LA Taq DNA聚合酶 0.4 μL?；靹蚝笏查g離心，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?6 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并按照試劑盒說明書回收產(chǎn)物。

1.2.4 山羊SPRN基因與T載體的連接、轉(zhuǎn)化、篩選與測序 將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上。反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中Slution Ⅰ 5 μL，pMD19-T載體1 μL，純化的PCR產(chǎn)物4 μL，16 ℃連接3 h。在-80 ℃冰箱取100 μL感受態(tài)細(xì)胞放置冰上，待融化后，將5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞，在冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，立即冰浴2 min，加入890 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩（180 r/min）1 h，離心（4 000 r/min，2 min），棄掉一部分上清液，取200 μL涂于預(yù)鋪有IPTG和X-gal的含Amp瓊脂平板上，37 ℃平放1 h后倒置培養(yǎng)過夜。

1.2.5 構(gòu)建真核表達(dá)載體

1）pMD19-T-SPRN和pEGFP-N1載體的雙酶切。總體積為50 μL，10×Buffer 5 μL，Bgl ⅡⅠ 2.5μL，EcoRⅠ 2.5 μL，質(zhì)粒DNA 20 μL，去離子水20μL。37 ℃，酶切3 h。

2）pEGFP-N1-SPRN的構(gòu)建。 取雙酶切后的SPRN基因完整編碼區(qū)片段5 μL，酶切后的pEGFP-N1 1 μL，10×T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，雙蒸水2 μL，總體積為10 μL，混勻，于37 ℃孵育3 h，然后于65 ℃終止反應(yīng)。取連接后的產(chǎn)物5 μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，篩選陽性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行電泳和酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊SPRN基因的PCR擴(kuò)增與克隆測序

2.1.1 山羊小腦組織總RNA的完整性 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性，結(jié)果如圖1。從圖1可以看到清晰的28S rRNA、18S rRNA兩條主帶以及較弱的5S rRNA帶，表明所提取的總RNA完整性較好，純度較高，可用于RT-PCR反應(yīng)。

2.1.2 山羊SPRN基因的PCR擴(kuò)增 利用RT-PCR擴(kuò)增山羊SPRN基因完整編碼區(qū)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示，得到了一條特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致，約為488 bp，擴(kuò)增的特異性較強(qiáng)（圖2）。

2.2 山羊SPRN基因重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-SPRN的酶切鑒定

利用瓊脂糖凝膠電泳對酶切后的重組陽性真核表達(dá)載體pEGFP-N1-SPRN進(jìn)行檢測，電泳結(jié)果與預(yù)計(jì)的結(jié)果相一致，酶切片段大小分別為4 700 bp和488 bp，表明山羊SPRN基因完整編碼區(qū)已成功地克隆到pEGFP-N1載體上（圖3）。

3 討論

經(jīng)過對構(gòu)建的真核表達(dá)載體測序，結(jié)果證明，所克隆的山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的序列是正確的。山羊SPRN基因完整編碼區(qū)經(jīng)雙酶切后連接于pEGFP-N1載體上。pEGFP-N1全長為4.7 kb，構(gòu)建的pEGFP-N1-SPRN載體長度約為5.2 kb，酶切鑒定結(jié)果表明，SPRN基因完整編碼區(qū)成功克隆到了真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，其在真核細(xì)胞中的表達(dá)為研究該基因的亞細(xì)胞定位與功能提供了必要的條件。

參考文獻(xiàn)：

[1] PREMZL M， SANGIORGIO L， STRUMBO B， et al. Shadoo， a new protein highly conserved from fish to mammals and with similarity to prion protein[J]. Gene，2003，314：89-102.

[2] WESTAWAY D， DAUDE N， WOHLGEMUTH S， et al. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel[J]. Top Curr Chem，2011，305：225-256.

[3] WATTS J C， DRISALDI B，VIVIAN N G， et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP（C）-like protective properties and displays reduced levels in prion infections[J].The EMBO Journal，2007，26（17）：4038-4050.

[4] UBOLDI C，PAULIS M，GUIDI E， et al. Cloning of the bovine prion-like Shadoo （SPRN） gene by comparative analysis of the predicted genomic locus[J]. Mamm Genome，2006，17（11）：1130-1139.

[5] LAMPO E， POUCKE M V， HUGOT K， et al. Characterization of the genomic region containing the Shadow of Prion Protein （SPRN） gene in sheep[J].BMC Genomics，2007，8（1）：138.

[6] LAMPOE W，BROECK V D， WILLEMARCK N， et al. Distribution of the Shadoo protein in the ovine brain assessed by immunohistochemistry[J].Res Vet Sci，2011，90（3）：372-378.

[7] 劉 利，張路培，高 雪，等.牛PU1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（11）：69-72.

[8] 蔣雅麗，陶艷婷，胡曉燕，等.pEGFP-N1-ZIP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對人T淋巴和單核細(xì)胞系鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，50（4）：24-28.

[9] 韋光輝，徐廷生，雷雪芹，等.牛生長激素BGH基因的克隆及其真核表達(dá)載體pEGFP-N1-BGH的構(gòu)建[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：33.

[10] 夏玉鳳.以gfp為報(bào)告基因研究蛋白亞細(xì)胞定位[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2006（2）：11-13.

（責(zé)任編輯 程碧軍）