摻雜玉米茶葉的基因組DNA提取與PCR檢測(cè)方法建立

摘要：根據(jù)玉米內(nèi)源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)CTAB法適合提取茶葉樣品基因組DNA，實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，普通PCR能達(dá)到1%，實(shí)時(shí)熒光PCR是普通PCR的10倍。兩種方法都能達(dá)到檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：茶葉（Camellia sinensis）；玉米（Zea mays）；普通PCR；實(shí)時(shí)熒光PCR；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：Q78；S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5615-03

目前，我國(guó)的茶葉（Camellia sinensis）年消費(fèi)量已高達(dá)66萬t，人均飲茶量0.45 kg/年。茶對(duì)我國(guó)的社會(huì)歷史文化和現(xiàn)實(shí)生活都產(chǎn)生了重要影響[1]。茶葉質(zhì)量安全主要包括茶葉摻假、農(nóng)藥殘留、重金屬污染、有害微生物污染、磁性物和粉塵污染等因素[2，3]。其中茶葉中摻假的問題近年來越發(fā)嚴(yán)重，一些不法商販為了獲取高額利潤(rùn)在茶葉中摻雜各種谷類物質(zhì)，以次充好，以假冒真。茶葉摻假的方式有：以類似茶葉的其他植物葉冒充茶葉；在真茶葉中摻入假、次茶葉；曬干飲用過的茶葉重新銷售等[4]。此外，茶葉中還出現(xiàn)了摻淀粉、甘薯粉、面粉或其他谷類淀粉加水、加熱促成淀粉糊，于茶葉初制或再加工過程中加入，其目的或是將末茶重新造形，促成條狀；或是將粗老茶特別是回籠茶（泡過的茶葉）揉成條，并增進(jìn)重實(shí)感；或是利用淀粉糊的黏性，摻入一些沙土、木灰、煤屑等以增重；或上述摻偽兼而有之[5]。

PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)[6]，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料中外源成分的檢測(cè)。本研究根據(jù)玉米（Zea mays）內(nèi)源ZEIN基因建立了茶葉中摻雜玉米的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以期能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出茶葉中摻雜的玉米。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉和玉米購(gòu)自寧波市歐尚超市散裝商品（樣品在小型食品加工機(jī)中充分加工成細(xì)粉）。Taq DNA聚合酶和dNTPs等PCR試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

稱取含有10%玉米的茶葉樣品200 mg和純玉米樣品20 mg分別采用標(biāo)準(zhǔn)CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和試劑盒法提取兩種樣品基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA濃度。

1.3 不同濃度梯度玉米的茶葉樣品基因組DNA的提取

將玉米樣品摻入到茶葉中，分別配制成濃度為10.0%、3.0%、1.0%和0.1%的茶葉樣品，并利用標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取基因組DNA，用U-0080D型生物分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA濃度。

1.4 PCR 擴(kuò)增

1）實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增[9]。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系參照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit說明。20 μL反應(yīng)體系為：20 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL、20 μmol/L熒光探針0.8 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、2×TaKaRa Premix Ex Taq 10.0 μL、Rnase-free water 4.0 μL，DNA模板4.0 μL。每樣品設(shè)一個(gè)平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。

2）普通PCR擴(kuò)增[10，11]。普通PCR反應(yīng)體系為：20 μmol/L上、下游引物各0.4 μL、Rnase-free water 5.2 μL、2×Taq Mastermix 10.0 μL，最后加入4.0 μL DNA模板，總體積20 μL。每樣品設(shè)一個(gè)平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)束后在ABI Prism 7000中觀察并記錄結(jié)果；普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在GelDoc-EQ（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種方法提取含10.0%玉米的茶葉樣品基因組DNA濃度和純度

由表1可知，試劑盒法提取的基因組DNA濃度較低，純度與另外兩種方法相差不大，改良CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度比標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的基因組DNA的濃度和純度都要高，但相差不大。

2.2 茶葉樣品普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

3種提取方式都有清晰而明顯的擴(kuò)增條帶，其中標(biāo)準(zhǔn)CTAB法得到的基因組DNA擴(kuò)增條帶最亮（圖1A）。標(biāo)準(zhǔn)CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA都有明顯的擴(kuò)增曲線（圖1B）。結(jié)合DNA濃度檢測(cè)結(jié)果，3種方法提取到的基因組DNA純度相近，但標(biāo)準(zhǔn)CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因組DNA濃度更高。而標(biāo)準(zhǔn)CTAB法更加簡(jiǎn)潔，所用時(shí)間更短，因此確定了最適合的提取方法為標(biāo)準(zhǔn)CTAB法。

含1.0%、3.0%和10.0%玉米的茶葉樣品DNA有擴(kuò)增條帶，而含0.1%玉米的基因組DNA沒有擴(kuò)增條帶（圖2A），因此普通PCR能達(dá)到的檢測(cè)靈敏度為1.0%。含0.1%、1.0%、3.0%和10.0%玉米的基因組DNA都有顯著擴(kuò)增曲線（圖2B），因此實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，是普通PCR的10倍。

3 小結(jié)與討論

本研究以建立茶葉中摻雜玉米成分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR兩種檢測(cè)方法為目標(biāo)，優(yōu)化了核酸提取的方法。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的DNA純度和得率都較高；改良CTAB法提取的DNA純度和得率也都較高，與標(biāo)準(zhǔn)CTAB法提取的DNA純度和得率差異不大，但是其耗費(fèi)時(shí)間更長(zhǎng)，所用試劑更多；試劑盒法提取的DNA雖然純度和其他兩種方法的差異不大，所用時(shí)間更短，但是其得率不高且成本較高。因此確定了標(biāo)準(zhǔn)CTAB法為最適合的核酸提取方法。實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)茶葉中摻雜玉米成分的優(yōu)點(diǎn)在于：①對(duì)玉米目的基因進(jìn)行擴(kuò)增后，不再需要凝膠電泳檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，且不再需要接觸到EB；②準(zhǔn)確性很高，不容易出現(xiàn)假陽性，特異性更強(qiáng)[12]。實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%，普通PCR能達(dá)到1.0%，實(shí)時(shí)熒光PCR是普通PCR的10倍。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱永興.茶的功效及其運(yùn)用（一）[J].中國(guó)茶葉加工，2010，（3）：43-45.

[2] 劉聲傳，羅顯揚(yáng).茶葉質(zhì)量安全生產(chǎn)與可持續(xù)發(fā)展研究[J].貴州茶葉，2010，38（2）：3-5.

[3] 梅 峰.國(guó)際茶市現(xiàn)狀與中國(guó)茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[J].中國(guó)茶葉加工，2009，1（3）：326.

[4] 顏 琪.茶葉中摻假怎樣鑒別檢驗(yàn)[J].監(jiān)督與選擇，2006（1）：23.

[5] 林瑞勛.茶中摻淀粉的快速檢驗(yàn)[J].福建茶葉，1992（1）：29.

[6] TURNI C，PYKE M，BLACKALL P J.Validation of a real-time PCR for Haemophilus parasuis[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，108（4）：1323-1331.

[7] 陶 李，張富麗，宋 君.轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)中4種DNA提取方法比較[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（12）：52-53.

[8] 黃永蓮，劉 媛，黃真池.植物總DNA的提取方法的改進(jìn)[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28（3）：105-111.

[9] SN/T1196-2003，玉米中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)方法[S].

[10] SPAGNUOLO-EAVER M，WALKER I，CAMPBELL S，et al.Rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome viral nucleic acid in blood using a fluorimeter based PCR method[J]. Veterinary Microbiology，2000，76（1）：15-23.

[11] 郭 慶，王忠躍，孔繁芳，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在植物害蟲研究中的應(yīng)用[J].江西植保，2011，34（2）：48-53.

[12] 丁遠(yuǎn)杰.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

（責(zé)任編輯 屠 晶）