肉質(zhì)相關(guān)基因TCAP啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子MyoD結(jié)合的ChIP分析

摘要：為了檢測肉質(zhì)相關(guān)基因TCAP（Titin-cap，Telethonin）啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子MyoD（Myogenic differentiation antigen）的體內(nèi)結(jié)合情況，采用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）結(jié)合PCR技術(shù)分析TCAP啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合。結(jié)果表明，以MyoD抗體免疫沉淀的DNA片段為模板，PCR擴(kuò)增獲得了TCAP基因啟動(dòng)區(qū)121 bp的片段，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子MyoD與TCAP啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合。試驗(yàn)證實(shí)TCAP基因是MyoD調(diào)控的下游基因，在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：染色質(zhì)免疫共沉淀；TCAP基因；MyoD轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5612-03

動(dòng)物的產(chǎn)肉潛力及肌肉品質(zhì)與肌纖維的數(shù)量和生長密切相關(guān)。TCAP（Titin-cap，Telethonin）蛋白作為一種肌絲蛋白在肌原纖維的組裝過程中發(fā)揮著重要作用，其在橫紋肌和心肌中特異性表達(dá)，是肌聯(lián)蛋白激酶的作用底物，并綁定于肌聯(lián)蛋白Z1-Z2區(qū)，通過連接和支撐肌聯(lián)蛋白為其他肌纖維蛋白提供空間上固定的結(jié)合位點(diǎn)[1]。TCAP基因與肌肉萎縮[2]、心肌癥[3，4]、肌營養(yǎng)不良[5]等均相關(guān)。在培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞中，通過RNA干擾發(fā)現(xiàn)TCAP基因下調(diào)表達(dá)后會抑制成肌細(xì)胞的分化[6]，這些都證實(shí)了TCAP基因與骨骼肌發(fā)育關(guān)系密切。

TCAP基因由2個(gè)外顯子組成，在人、鼠和豬中編碼167個(gè)氨基酸，在牛中編碼166個(gè)氨基酸[7]，且在不同物種間高度保守[8]。研究表明牛TCAP基因內(nèi)含子1和外顯子2的SNP位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)[9]。黃京書[10]克隆了豬TCAP基因并發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNP位點(diǎn)，且G334A位點(diǎn)基因型與豬屠宰率、瘦肉率、6～7腰椎間背膘厚、胸腰椎間背膘厚、臀部平均背膘厚、三點(diǎn)平均背膘厚、眼肌高、眼肌寬、至第一頸椎胴體長、至第一胸肋胴體長極顯著相關(guān)，且肥肉率、肩部背膘厚、瘦肥比率性狀在不同基因型間的差異也達(dá)到顯著水平。

TCAP基因?qū)ωi肉質(zhì)性狀有著密切影響，但是其作用的具體機(jī)制還不明確。課題組在前期工作中克隆了豬TCAP基因啟動(dòng)子1 662 bp序列，構(gòu)建了7個(gè)啟動(dòng)子缺失片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。結(jié)果表明，各個(gè)片段的啟動(dòng)子活性都顯著提高，其中-155 bp/+33區(qū)段啟動(dòng)子活性最高，推測為潛在的核心啟動(dòng)子區(qū)。利用生物信息學(xué)技術(shù)對豬TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)序列做進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)存在調(diào)控肌肉生長發(fā)育的肌分化因子（Myogenic differentiation antigen，MyoD）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，且將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子MyoD超表達(dá)載體與TCAP基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性明顯升高，說明MyoD對TCAP基因的表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。故試驗(yàn)采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）體內(nèi)驗(yàn)證TCAP基因啟動(dòng)子序列與轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合情況，進(jìn)一步探討TCAP基因影響肉質(zhì)性狀的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細(xì)胞系來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對C2C12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試劑

染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒EZ-ChIPTM Chromatin Immunoprecipitation Kit，購自美國Millipore公司；MyoD兔抗鼠的單克隆抗體，購自英國Biorbyt公司；VC750型超聲波破碎儀，購自美國Sonics公司；BIO-RAD Mylyder PCR儀，購自美國BIO-RAD公司；Taq酶、dNTPs等PCR試劑，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞交聯(lián)固定 細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，添加含有1%甲醛的20 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，室溫孵育10 min后加甘氨酸終止交聯(lián)。置于冰上，用含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞，然后刮取細(xì)胞收集到離心管中，于4 ℃、800 r/min離心3 min，加入含蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸細(xì)胞，再按照每管400 μL分裝溶解物（約含4×106個(gè)細(xì)胞），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲波破碎細(xì)胞及條件優(yōu)化 調(diào)整超聲波破碎儀功率大小、破碎時(shí)間、停頓時(shí)間、重復(fù)次數(shù)等條件，在冰上破碎細(xì)胞，使染色質(zhì)DNA成為200～1 000 bp的片段，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄不容物，將DNA純化后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察剪切效果。

1.3.3 染色質(zhì)免疫沉淀 每100 μL溶解物中含1×106個(gè)細(xì)胞，加入900 μL含蛋白酶抑制劑的ChIP稀釋緩沖液、60 μL蛋白G-瓊脂糖，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育60 min，5 000 r/min離心1 min獲得瓊脂糖顆粒（去除非特異結(jié)合的分子），將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并取出10 μL（1%）作為“Input”對照。在剩余上清液中，加入相應(yīng)的抗體到上清液中，陽性對照中加入1 μg RNA PolymeraseⅡ抗體；陰性對照加入1 μg鼠IgG抗體；檢測樣本中加入2 μg MyoD抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。然后加入60 μL蛋白G-瓊脂糖，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育60 min（以收集抗體/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體），5 000 r/min離心1min，小心移除上清液（內(nèi)含未結(jié)合及非特異DNA）。最后依次用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCL洗滌緩沖液、TE緩沖液洗滌蛋白G/抗體/轉(zhuǎn)錄因子/DNA復(fù)合物。

1.3.4 解交聯(lián)及DNA純化 向復(fù)合物中加入200 μL洗脫緩沖液，輕彈管壁混勻，室溫放置15 min，5 000 r/min離心1 min，收集上清液，加入5 mol/L NaCl，并于65 ℃水浴5 h，以解交聯(lián)獲得游離DNA。加入RNase A 37 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mol/L EDTA、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.5）、蛋白酶K于45 ℃孵育60 min。采用試劑盒配套離心柱純化獲得DNA。

1.3.5 PCR鑒定 根據(jù)豬和小鼠TCAP基因序列，選擇包含預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。上游引物5′-GTGAGTCTTGGCTCTGCT

TA-3′，下游引物5′-TCTGCTATGTCCTGCTCCT-3′，采用20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（121 bp）以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波條件優(yōu)化

為了獲得最佳超聲波破碎條件，獲得200～1 000 bp的有效DNA片段（500 bp左右最佳），試驗(yàn)采用了8個(gè)不同條件來處理樣本（4×106個(gè)細(xì)胞），比較染色質(zhì)剪切效果（圖1），發(fā)現(xiàn)采用30%功率，破碎15 s，停頓50 s，重復(fù)15次可獲得500 bp左右片段，且降解較少。破碎時(shí)間太短，染色質(zhì)無法間斷；而功率過高、破碎時(shí)間太長會造成較多DNA片段降解。

2.2 染色質(zhì)免疫共沉淀檢測結(jié)果

分析豬和小鼠TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)序列，選擇保守區(qū)域且包含預(yù)測的MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)PCR引物，以免疫沉淀的DNA片段為模板，目的片段為121 bp。陽性對照以RNA PolymeraseⅡ抗體免疫沉淀的DNA為模板，陰性對照以鼠IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，Input對照以沒有進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)的DNA為模板，空白對照無DNA模板。結(jié)果（圖2）表明，陽性對照和Input對照均有目的擴(kuò)增條帶，而陰性對照和空白對照未檢測到目的擴(kuò)增條件，說明試驗(yàn)結(jié)果正確可信。采用MyoD抗體免疫沉淀的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的擴(kuò)增條帶，且對擴(kuò)增產(chǎn)物測序鑒定序列正確無誤，證實(shí)在C2C12細(xì)胞中MyoD轉(zhuǎn)錄因子可與TCAP基因啟動(dòng)區(qū)DNA序列結(jié)合。

3 小結(jié)與討論

研究報(bào)道表明TCAP基因在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且與豬和牛等動(dòng)物的肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)，但是其作用機(jī)制還不清楚。在課題組前期研究工作中，發(fā)現(xiàn)TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)存在MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，且將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子MyoD超表達(dá)載體與TCAP基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性明顯升高。而試驗(yàn)采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP），在C2C12細(xì)胞中證實(shí)TCAP基因啟動(dòng)子序列與轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合，說明MyoD參與TCAP基因的表達(dá)調(diào)控。

MyoD是成肌調(diào)節(jié)因子（MRF）家族成員之一，不僅可促使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且能把成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并可促進(jìn)成肌細(xì)胞進(jìn)一步融和、分化為成熟的肌纖維。在形成肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著總開關(guān)的作用[11]。MyoD缺失可導(dǎo)致成肌細(xì)胞的增殖和分化無法進(jìn)行[12]，如應(yīng)用基因敲除試驗(yàn)表明缺乏MyoD和Myf5的小鼠沒有肌肉形成，沒有肌肉標(biāo)志出現(xiàn)，也沒有myogenin促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄過程。僅有Myf5而沒有MyoD基因的小鼠，僅表達(dá)半量的Myf5和myogenin RNA。敲除myogenin基因，在胚胎鼠正常數(shù)目的肌細(xì)胞發(fā)生部位可產(chǎn)生幾乎正常數(shù)目的成肌細(xì)胞，但不能向肌細(xì)胞分化。田璐等[13]研究了3個(gè)黃牛品種及4個(gè)雜交肉牛群體MyoD基因的多態(tài)性，并發(fā)現(xiàn)其顯著影響肉牛多個(gè)肉質(zhì)性狀，如宰前活重、胴體重、凈肉重、高檔肉重、眼肌面積等。邱海芳等[14]采用PCR-RFLP方法對通城豬、大白豬和長白豬3個(gè)純種及長大通豬和大長通豬2個(gè)三元雜種共5個(gè)群體MyoD基因第1內(nèi)含子的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該基因變異會顯著影響豬肉的肉色評分是失水率；還發(fā)現(xiàn)豬MyoD區(qū)域與人和小鼠是保守的，而且這個(gè)區(qū)域存在影響生長和肉質(zhì)性狀的QTL，揭示MyoD基因在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MyoD與TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)DNA序列結(jié)合，TCAP基因可能是MyoD調(diào)控的一個(gè)下游基因，肌分化因子決定因子MyoD激活后，能進(jìn)一步激活TCAP基因的表達(dá)，為肌纖維蛋白提供空間上的結(jié)合位點(diǎn)，有利于肌原纖維的組裝，促進(jìn)成熟的肌纖維形成。這也從側(cè)面證實(shí)了TCAP基因在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，然而其是否受其他肌肉發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，及具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）