歐文氏桿菌鐵代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

摘要：利用生物信息學(xué)軟件對歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）基因組中與鐵代謝相關(guān)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，共篩選到71個(gè)與鐵代謝相關(guān)的基因，其中，有51個(gè)為已知功能基因，20個(gè)為推測功能基因。在獲得的71個(gè)基因中，12個(gè)基因參與鐵載體合成、27個(gè)基因與Fe3+吸收有關(guān)、3個(gè)基因與Fe2+吸收有關(guān)、10個(gè)基因與亞鐵血紅素吸收有關(guān)、1個(gè)基因與編碼貯鐵蛋白有關(guān)、7個(gè)基因與鐵吸收調(diào)控有關(guān)、還有11個(gè)基因可能與鐵代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞：歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）；鐵代謝相關(guān)基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5606-03

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，利用生物信息學(xué)方法研究生命現(xiàn)象與機(jī)制已成為新的研究熱點(diǎn)。軟腐病菌中的歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）SCRI1043的全基因組序列已公布[1-3]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選歐文氏桿菌基因組中與鐵代謝有關(guān)的基因，并進(jìn)行相關(guān)分析，為控制軟腐病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中歐文氏桿菌SCRI1043（以下簡稱Eca1043）的基因組，將Eca1043的基因組中每一個(gè)編碼序列Coding sequence（CDS）利用DNAMAN軟件轉(zhuǎn)化為FASTA蛋白的格式，與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的28個(gè)完全注解的腸桿菌科細(xì)菌的CDS進(jìn)行BLAST比對，找出該菌株中所有與鐵代謝相關(guān)的基因，并使用DNAStar和TreeView軟件對其進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

Eca1043菌株的基因組大小為5 064 019 nt，G+C含量為50.97%，4 614個(gè)已預(yù)測的CDS，其中有20個(gè)假基因，7個(gè)rRNA操縱子，76個(gè)tRNA。通過與28個(gè)完全注解腸桿菌科細(xì)菌的全部CDS進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)了71個(gè)與鐵代謝相關(guān)的基因，其中包括12個(gè)參與鐵載體合成的基因，27個(gè)基因與Fe3+吸收相關(guān)的基因，3個(gè)與Fe2+吸收相關(guān)的基因，10個(gè)與亞鐵血紅素吸收相關(guān)的基因，1個(gè)與貯鐵蛋白相關(guān)的基因，7個(gè)與鐵調(diào)控相關(guān)的基因，11個(gè)其他可能與鐵代謝相關(guān)的基因。

2.1 鐵載體生物合成系統(tǒng)

通過序列比對，Eca1043菌株中與鐵代謝相關(guān)基因與大腸桿菌（Escherichia coli）中某些基因具有較高的相似性，ECA0475、ECA0474、ECA0477、

ECA0478、ECA0479、ECA0480、ECA0481、ECA2023、ECA3781、ECA4116基因與腸菌科中大腸桿菌中cirA、entD、entC、entE、entB、entF、entA、iucC、fepA、 iucC基因的氨基酸序列相似性分別為36.61%、32.53%、46.30%、64.63%、62.94%、30.30%、60.32%、29.47%、63.71%、29.47%。ECA0731、ECA3985基因的氨基酸序列與假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）基因的氨基酸序列相似性分別為58.60%、74.36%。由于大腸桿菌中entD、entC、entE、entB、entF、entA基因編碼的蛋白與鐵載體的生物合成有關(guān)[4]，推測Eca1043菌株中的ECA0475、ECA0474、ECA0477、ECA0478、ECA0479、ECA0480、ECA0481基因也應(yīng)該與歐文氏桿菌鐵載體生物合成相關(guān)。

2.2 Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因

在Eca1043菌株的基因組中發(fā)現(xiàn)12個(gè)Fe3+-鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)子，其中包括Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)子、Fe3+ ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)子、Fe3+-二檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子。12個(gè)Fe3+-鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)子中有4個(gè)操縱子包括11個(gè)基因（ECA1492—ECA1494，ECA2561—ECA2564、ECA3243、

ECA4254—ECA4256）編碼Fe3+ ABC轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，有1個(gè)操縱子包括3個(gè)基因（ECA3310—ECA3312）編碼鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，有1個(gè)操縱子包括6個(gè)基因（ECA1073—ECA1078）編碼Fe3+-二檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，有1個(gè)操縱子包括2個(gè)基因（ECA3138—ECA3139）編碼Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，還有5個(gè)操縱子包括5個(gè)基因（ECA0350、ECA0814、ECA1510、ECA1775、ECA2718）尚無法確定具體功能。

2.3 Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因

細(xì)菌中Fe2+吸收與Fe3+吸收是同等重要的[5]。在Eca1043菌株的基因組中，不但發(fā)現(xiàn)了與Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因，還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因ECA3277、ECA3933、ECA4308，并與大腸桿菌的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因feoB、fieF同源性很高。

2.4 亞鐵血紅素吸收系統(tǒng)相關(guān)基因

大多數(shù)細(xì)菌在生長階段需要鐵，而在侵染階段則需要亞鐵血紅素[5-7]，所有已被證實(shí)的能使亞鐵血紅素降解的酶都是單加氧酶作為亞鐵血紅素的加氧酶。目前，已證實(shí)在金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的亞鐵血紅素的吸收系統(tǒng)蛋白是由一簇isd（Iron-regulated surface determinants）基因編碼的[8]。在Eca1043菌株的基因組中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與亞鐵血紅素吸收相關(guān)的基因，其中8個(gè)基因功能已知，還有2個(gè)基因功能為預(yù)測的。ECA1882—ECA1885與大腸桿菌中與亞鐵血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因ccmA、ccmB、ccmC、ccmD具有高度的相似性，ECA2116—ECA2118與假結(jié)核菌中和溶血素蛋白相關(guān)的基因YPTB3461、YPTB3460、YPTB3459具有高度相似性。此外，ECA0056、ECA1537、ECA1538與假結(jié)核菌中與亞鐵血紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因hmuR、hasA、hasR具有高度相似性。

2.5 鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)基因（Fur）及其同系物

Fur是鐵吸收相關(guān)基因的重要調(diào)節(jié)子，在細(xì)菌的生長和侵染過程中起著重要作用。與鐵吸收相關(guān)的大多數(shù)基因中都有一個(gè)保守的上游Fur結(jié)合位點(diǎn)（Fur-Box），在鐵充足的條件下，F(xiàn)ur蛋白結(jié)合Fe2+，然后結(jié)合到Fur-Box上，導(dǎo)致Fur調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄受阻。Fur蛋白根據(jù)胞內(nèi)鐵的有效濃度來調(diào)節(jié)細(xì)菌的鐵代謝，除Fur基因外，還發(fā)現(xiàn)了與Fur基因功能相近的6個(gè)基因，1個(gè)是zur基因（ECA0632），編碼依賴鋅的阻遏物；1個(gè)編碼鐵蛋白的基因（ECA2473）和4個(gè)其他與Fur基因功能相近的基因（ECA1941、ECA3778、ECA3833、ECA3834），均與大腸桿菌中的相應(yīng)基因具有很高的相似性。

Fe2+-Fur復(fù)合物通常結(jié)合在被抑制基因啟動子之間，最初發(fā)現(xiàn)Fur結(jié)合位點(diǎn)與己知的Fur-box的19 bp回文序列（GATAATGATAATCATTATC）相一致[9]。在大腸桿菌染色體的任何位置都沒有發(fā)現(xiàn)這種嚴(yán)格的序列，F(xiàn)ur結(jié)合位點(diǎn)可能只匹配一致序列的11/19堿基，如TonB[10]。本研究利用Fur-box的19 bp的回文序列找到了26個(gè)推測的Fur-box，這些基因參與了鐵載體的生物合成以及鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存和調(diào)控。

2.6 貯鐵蛋白相關(guān)基因及其他與鐵吸收相關(guān)基因

鐵蛋白是在細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的貯鐵蛋白的一類，為中空的球形粒子形態(tài)，其中貯存2 000到4 500個(gè)三價(jià)鐵原子。鐵蛋白的粒子直徑大約在8～12 nm，為調(diào)節(jié)鐵進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)部的運(yùn)輸通道。細(xì)菌中有兩種形式的鐵蛋白，一種是含有亞鐵血紅素的鐵蛋白，另一種是不含亞鐵血紅素的鐵蛋白。鐵蛋白在革蘭氏陰性菌中的主要作用是貯鐵，以及防止金屬毒性和氧化，在不同的菌株中鐵蛋白的調(diào)控和功能顯著不同[11]。在Eca1043中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼鐵蛋白的基因ECA2473（表1）與大腸桿菌中編碼鐵蛋白的基因ftn同源性很高。

除了以上與貯鐵蛋白相關(guān)的基因外，還找到了可能與鐵吸收相關(guān)的11個(gè)基因，其中有9個(gè)基因?yàn)橐阎δ艿幕颍?個(gè)基因?yàn)轭A(yù)測功能的基因。5個(gè)基因（ECA1197、ECA1898、ECA3232、ECA3273、ECA4269）與大腸桿菌中與鐵氧還蛋白相關(guān)的基因（yfaE、napF、fdx、yfhL、ECs4849）具有很高相似性，6個(gè)基因（ECA1181、ECA2392—ECA2395、ECA2395）與大腸桿菌中與鐵螯合蛋白相關(guān)基因（hemH、sitA、SitB、sitC、SitD、c2517）具有很高的同源性。

3 小結(jié)與討論

基因組序列測定使微生物研究手段發(fā)生了革命性改進(jìn)。自1995年嗜血流感菌（Haemophilus influenza）基因組序列發(fā)表以來，已有312種細(xì)菌基因組全序列完成測序（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Complete.html），包括26種古細(xì)菌，286種真細(xì)菌。截至2013年9月，收錄在GenBank已測基因組全序列的植物病原細(xì)菌種類達(dá)31種，依靠傳統(tǒng)的研究思想和試驗(yàn)手段注釋如此龐大的生物信息資源幾乎是不可能的。生物信息學(xué)的首要任務(wù)之一是分析新基因的功能，即從大量不連續(xù)的信息中發(fā)現(xiàn)其中隱藏著的重要信息。

通過多重序列比對篩選保守序列是生物信息學(xué)方法的基礎(chǔ)，幾乎所有的注釋序列的意義、研究序列結(jié)構(gòu)的方法都是建立在此基礎(chǔ)上的。保守序列是指病毒在進(jìn)化過程中基因組序列保持不變或變異很小的序列。在進(jìn)化過程中，變化很小或者不變的序列往往承擔(dān)著極其重要的功能，一旦出現(xiàn)變化，功能就會受影響或者被破壞，物種就有被淘汰的危險(xiǎn)。因此，保持不變或變化很小的序列可能具有相同的功能。國際上已有專門的數(shù)據(jù)庫（如Blocks、PROSITE和IDENTIFY）和分析軟件（如BLAST、DNAsis、FASTA、GCG、MOST、Emotif和Tool）用于保守序列的分析。

本研究利用生物信息學(xué)方法對歐文氏桿菌基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了71個(gè)與鐵代謝相關(guān)的基因，分別參與了歐文氏桿菌中鐵載體的生物合成以及鐵的運(yùn)輸、吸收、貯存和調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）