轉(zhuǎn)EGFP—attB基因PK15細(xì)胞核型分析方法的建立

摘要：以轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞15）為試驗(yàn)材料，研究不同秋水仙素濃度、低滲時(shí)間對染色體標(biāo)本制備的影響。結(jié)果表明，使用秋水仙素濃度為0.04～0.08 μg/mL、低滲時(shí)間為15～20 min時(shí)所制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，可以做核型分析用，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測研究轉(zhuǎn)EGFP-attB基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬腎細(xì)胞15；轉(zhuǎn)基因；EGFP-attB基因；核型分析

中圖分類號：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5603-03

隨著國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)積極穩(wěn)妥地推動實(shí)施，以及國家對轉(zhuǎn)基因及生物育種的研究、安全性評價(jià)和管理的重視，人們對保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的意識逐漸加強(qiáng)[1-7]。目前，美、歐、日已經(jīng)開始授權(quán)動物專利，而中國專利局暫不接受涉及動植物的產(chǎn)品權(quán)利。轉(zhuǎn)基因動植物品種的育種人僅僅可對被轉(zhuǎn)基因及其應(yīng)用申請專利而間接保護(hù)轉(zhuǎn)基因動植物或動植物品種，或?qū)ζ浞巧飳W(xué)的轉(zhuǎn)基因方法及其應(yīng)用申請專利保護(hù)，并以轉(zhuǎn)基因方法專利延及保護(hù)該轉(zhuǎn)基因方法直接獲得的轉(zhuǎn)基因動植物，所以，針對轉(zhuǎn)基因育種素材中外源基因的檢測越來越受到重視。轉(zhuǎn)基因豬的插入序列一般整合于宿主細(xì)胞染色體上，常以染色體原位雜交的方法來確定插入序列整合在某一條染色體的具體位點(diǎn)。本研究利用轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞制備染色體，為染色體原位雜交檢測外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），F(xiàn)BS（HyClone公司），PI（Sigma公司），無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen公司），Opti-MEM（Invitrogen公司），秋水仙素（Duchefa公司），Anti-digoxigenin-fluorescein、Nick-translation-Labeling-DNA-dUTP（Roche公司），正置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）、載玻片及蓋玻片（FanYi公司），LSM 510 META共聚焦顯微鏡（Zeiss公司）。

1.1.2 質(zhì)粒 PhiC31整合酶表達(dá)載體pCMV-Int和報(bào)告載體pBCPB+由斯坦福大學(xué)Michelle M. Calos教授饋贈；表達(dá)載體pEGFP-N1、大腸桿菌DH5α、PK15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞15）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室保藏。引物序列為：attB-F，5′-GTCATTAATCGCCATTCAGGCTGCGCA-3′；attB-R，5′-GTCATTAATCTCGGCCTCGACTCTAG

-3′。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 以attB-F和attB-R為引物，PCR擴(kuò)增attB基因序列，PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、dNTPs 2.0 μL、Taq DNA聚合酶1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模版 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。利用Ase Ⅰ酶切attB基因序列和pEGFP-N1載體，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR及酶切鑒定陽性克隆，構(gòu)建為定點(diǎn)整合載體pEGFP-N1-attB。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 500 ng pCMV-Int、10 ng pEGFP-N1-attB、1.2 μL Lipofectamine 2000、適量的Opti-MEM混合后室溫下孵育20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后逐滴加到培養(yǎng)基中，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后加入600 μg/mL G418開始篩選。14 d后挑取單克隆，轉(zhuǎn)移到6孔板擴(kuò)繁、凍存。

1.2.3 探針標(biāo)記 采用Roche試劑盒DIG-nick translation mix標(biāo)記探針。取1 μg pEGFP-N1-attB質(zhì)粒溶解于16 μL ddH2O中，加入4 μL DIG-nick translation mix，瞬時(shí)離心混勻后于15 ℃作用90 min，加入1 μL 0.5 mmol/L EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，然后加熱至65 ℃使酶失活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 染色體制備 在培養(yǎng)終止前加入不同濃度的秋水仙素，處理2 h，胰酶處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用2～5 mL的0.56% KCl溶液低滲細(xì)胞，低滲時(shí)間為15～60 min，然后加0.8～2.0 mL的固定液（甲醇∶冰醋酸，體積比為3∶1）輕輕混勻；1 000 r/min離心5 min，用1 mL新的固定液重新懸浮細(xì)胞，制片前根據(jù)懸浮細(xì)胞數(shù)調(diào)整懸液的體積，直接滴加細(xì)胞懸液至1～2片玻片上，每片2個(gè)雜交區(qū)（每個(gè)區(qū)域15～25 μL細(xì)胞懸液），晾干。

1.2.5 染色及雜交 在Gimsa染液中染色10 min，流水中洗去多余的Gimsa染液，晾干，在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相并照相。37 ℃雜交16 h后，依次分別用50%甲酰胺、2×SSC、0.1×SSC洗滌，45 ℃洗2次，每次5 min，信號經(jīng)羅氏Anti-digoxigenin-fluorescein試劑盒放大。DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞驗(yàn)證

構(gòu)建成功的EGFP-attB基因表達(dá)載體（圖1）經(jīng)轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞經(jīng)過14 d的G418篩選，發(fā)現(xiàn)全部表達(dá)綠色熒光蛋白（圖2），表明得到的是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，EGFP-attB基因已經(jīng)整合到PK15細(xì)胞的染色體上。

2.2 染色體標(biāo)本制備與染色

用穩(wěn)轉(zhuǎn)的PK15細(xì)胞為材料作染色體標(biāo)本，用Gimsa染色后在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相（圖3）。從圖3可以看出，使用終濃度為0.04～0.08 μg/mL秋水仙素、低滲時(shí)間為15～20 min時(shí)所制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，可以做核型分析用。

2.3 共聚焦顯微鏡下的檢測

將所制標(biāo)本經(jīng)DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并采集數(shù)據(jù)。使用軟件LSM Image Examiner分析，染色體標(biāo)本分裂相分散好（圖4），可以做核型分析用。

3 小結(jié)與討論

應(yīng)用FISH（Fluorescence in situ hybridization）技術(shù)檢測外源基因的成功率受探針（種類、大小、標(biāo)記效率）、標(biāo)本（種類、處理方法）以及雜交、清洗條件、熒光抗體檢測、熒光顯微鏡靈敏度等因素影響。其中探針大?。ǚ肿与s交探針的有效長度）對FISH檢出率具有限定作用，目前普遍認(rèn)為1 kb以下的探針難以成功用于FISH[8]。中期FISH檢出率較高，因?yàn)橹衅诜至严嗫赏ㄟ^染色體定位信號，不易受非特異信號干擾，且染色體分散，信號不易被覆蓋。而間期FISH則因特異信號與非特異信號呈現(xiàn)同一細(xì)胞核中，不易辨認(rèn)非特異信號，出現(xiàn)多信號（超過預(yù)期信號數(shù)）核，且可能由于信號有時(shí)不在同一平面上，出現(xiàn)少于預(yù)期信號數(shù)的核，檢出率較中期FISH低。在FISH應(yīng)用中，應(yīng)盡可能獲取高檢出率，但還要考慮信號特異性。FISH特異性取決于雜交特異性和免疫熒光檢測中抗原抗體反應(yīng)特異性，受相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件影響。因此，為獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，需根據(jù)探針和標(biāo)本情況改變實(shí)驗(yàn)條件，并觀察一定數(shù)量中期分裂相或間期細(xì)胞核，統(tǒng)計(jì)其檢出率，保證信號特異性。中期分裂相不易受非特異信號干擾，統(tǒng)計(jì)25個(gè)分裂相即可[9]。

本研究制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，染色體分散，信號不易被覆蓋，可以用于核型分析，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測研究轉(zhuǎn)EGFP-attB基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）