優(yōu)選腸癰Ⅱ號(hào)提取工藝

摘要：以HPLC法分析腸癰Ⅱ號(hào)君藥主成分含量，分光光度法分析總黃酮含量，結(jié)合總浸膏量為綜合參考指標(biāo)，通過對(duì)比回流提取法，微波提取法，超聲波提取法，優(yōu)選出提取腸癰Ⅱ號(hào)的最佳提取工藝。結(jié)果表明，超聲波法提取腸癰Ⅱ號(hào)綜合評(píng)分為6.12，回流法提取腸癰Ⅱ號(hào)綜合評(píng)分為5.96，微波法提取腸癰Ⅱ號(hào)綜合評(píng)分為5.93。超聲波提取為腸癰Ⅱ號(hào)的最佳提取方案，該方法可為復(fù)方中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞：腸癰Ⅱ號(hào)；正交試驗(yàn)；HPLC

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5581-04

腸癰Ⅱ號(hào)由君藥：敗醬草、二花；臣藥：地丁、丹皮、丹參；佐使藥：制附片、薏米仁、皂刺、木香、穿山甲等10味藥材構(gòu)成，具消腫散瘀、排膿解毒之效，效果甚佳。但傳統(tǒng)以水煎藥法對(duì)藥物的有效成分破壞較大及水煎液容易發(fā)霉變質(zhì)且雜質(zhì)較多，藥材利用率低并給患者帶來很多不便，針對(duì)此種現(xiàn)狀，采用適合于工業(yè)化生產(chǎn)的現(xiàn)代提取技術(shù)，對(duì)腸癰Ⅱ號(hào)提取工藝進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，以期為相關(guān)復(fù)方中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸癰Ⅱ號(hào)藥材（延安大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科中藥房提供，黃劍林主任藥師鑒定）。

乙醇、甲醇、乙酸乙酯和磷酸為分析純?cè)噭?，購于國藥試劑?zé)任有限公司；乙腈為色譜純?cè)噭?，購于Sigma公司；去離子水。

綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA、丹皮酚、蘆丁購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器

KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；194A07型MARS5（CEM公司）；SY-1000E恒溫超聲提取機(jī)（北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；TU-1810型紫外可見分光分度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；回流提取裝置（陜西西安儀器廠生產(chǎn)）；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；ME2353型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Agilent1200型液相色譜儀（美國安捷倫公司）；正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ V3.1專業(yè)版軟件。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程及綜合評(píng)分方法 工藝流程為：稱量樣品→無水乙醇提取→濾液→蒸干→HPLC及比色測定→綜合評(píng)分。綜合得分=（君藥主成分含量×60%+總黃酮含量×20%+浸膏量×20%/投樣量）×100。

1.3.2 HPLC定量方法 以腸癰Ⅱ號(hào)君藥中敗醬草、二花中的主成分化合物綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA、丹皮酚[1]為標(biāo)準(zhǔn)品，通過面積歸一法測定樣品中的含量。

1.3.3 HPLC色譜條件[2] 色譜柱Eclipse XOB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈和水（含0.08%磷酸，V/V），以梯度洗脫：在0～80 min，乙腈流動(dòng)相為5%～100%（V/V），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長274 nm，柱溫25 ℃。該色譜條件下綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA、丹皮酚4種標(biāo)品及樣品成分均被分離洗脫結(jié)果見表1。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的配制 分別精密稱取適量綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚用甲醇定容至10 mL，配成濃度分別為0.97、4.54、1.12和0.95 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密稱取100 mg樣品置于100 mL容量瓶中，加入甲醇充分溶解后定容，搖勻，取少量過0.45 μm濾膜，棄去初濾液，收集續(xù)濾液為供試品溶液。

1.3.5 流動(dòng)相洗脫程序 流動(dòng)相梯度洗脫程序見表2。

1.3.6 總黃酮的測定[3] 準(zhǔn)確稱取蘆丁5 mg，置于25 mL容量瓶中，用95%（V/V，下同）乙醇定容，用吸量管分別吸取其0～2.5 mL于25 mL容量瓶中，然后加入0.7 mL的5%（m/V，下同）NaNO2溶液，搖勻，放置5 min；加7 mL 10%Al（NO3）3（m/V）溶液搖勻，放置10 min；加 5 mL的1 mol/L NaOH搖勻，放置5 min，用95%乙醇定容至刻度。測定400～570 nm的吸光度。

準(zhǔn)確稱取樣品14.0 g，按設(shè)計(jì)方法提取，合并濾液，減壓濃縮至10 mL，以95%乙醇定容至25 mL。用吸管吸取3份0.5 mL樣品，分別置于25 mL容量瓶內(nèi)，測定步驟同上。計(jì)算公式：總黃酮含量//%=（比色濃度×1 mL×稀釋倍數(shù)/投樣質(zhì)量）×100%。

1.3.7 回流法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在相同條件下，選取提取溫度、時(shí)間、液料比3項(xiàng)為考察因素，按表3的因素水平試驗(yàn)。

1.3.8 微波法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4-8] 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在相同的投樣量（14.9 g）、粒度60目、提取次數(shù)3次（合并每次提取液）的一定條件下，選取輸出功率、時(shí)間、提取溫度、液料比4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，按表4的因素水平表安排試驗(yàn)。

1.3.9 超聲波法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在相同的投樣量（14.9 g）、粒度80目、提取次數(shù)3次（合并每次提取液）的一定條件下，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取輸出功率、提取時(shí)間、提取溫度、液料比4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，按表5的因素水平表安排試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)分析

2.1.1 穩(wěn)定性分析 將同一樣品按供試品溶液的制備方法制備后，每隔5 h測定1次，n=3，可知綠原酸、木犀草苷、丹參酮IIA和丹皮酚的RSD分別為2.1%、1.8%、1.2%和2.8%。說明綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2 重復(fù)性分析 將同一樣品用上述供試品溶液的制備方法制備5份，n=3，進(jìn)行HPLC分析。綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚的RSD分別為1.1%，2.3%，2.5%和1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 精密度分析 將同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，n=3，以峰面積計(jì)算綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚的RSD分別為2.1%，1.7%，2.3%和1.5%，表明該方法精密度良好。

2.1.4 HPLC的線性關(guān)系考察 精密吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作HPLC分析，以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度求得回歸方程，相關(guān)系數(shù)及線性范圍，其中綠原酸的線性回歸方程為y=900 000 000 x+790 790，R2=1.000 0，線性范圍為0～1 mg/mL；木犀草苷為y = 60 000 000 x-100 000，R2=0.999 7，線性范圍為0～4 mg/mL；丹參酮ⅡA為y= 200 000 000 x-600 000，R2=0.997 7，線性范圍為0～1 mg/mL；丹皮酚為y = 100 000 000 x + 374 218，R2=0.999 8，線性范圍為0～1 mg/mL。

2.1.5 回收率分析 取已知含量的樣品適量，加入一定量的綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按樣品制備方法制備，n=3，進(jìn)行HPLC分析，測得綠原酸、木犀草苷、丹參酮ⅡA和丹皮酚的回收率分別為98.7%（RSD=2.1%）、100.5%（RSD=2.7%）、99.4%（RSD=1.5%）和102.9%（RSD=3.1%）。

2.2 總黃酮工作曲線的繪制[3]

掃描蘆丁樣品溶液400～570 nm所對(duì)應(yīng)的吸收波長，確定最大吸收波長為508 nm；固定吸收波長為508 nm，以2號(hào)為參比溶液分別測定不同標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，計(jì)算線性回歸方程為y=0.012 4 x-0.006 2，R2=0.999 7

2.3 正交分析結(jié)果

2.3.1 回流提取法的正交試驗(yàn)結(jié)果 直觀分析與方差分析結(jié)果見表6、7。由表6可知，影響無水乙醇回流提取腸癰Ⅱ號(hào)的主次順序?yàn)锳>B>C。以空白項(xiàng)為誤差項(xiàng)做方差分析，結(jié)果見表7，由表7可知，A因素對(duì)結(jié)果有顯著性影響。其最佳工藝為A2B2C2，即提取溫度60 ℃，每次提取時(shí)間2 h，液料比20∶1。

2.3.2 微波提取法的正交試驗(yàn)結(jié)果 直觀分析與方差分析結(jié)果見表8。由表8可知，影響微波法提取腸癰Ⅱ號(hào)的主次順序?yàn)锳>B>D>C。以極差最小項(xiàng)C為誤差項(xiàng)做方差分析，結(jié)果見表9。由表9可知，A因素對(duì)本試驗(yàn)有顯著性影響。綜合考慮最佳工藝為A2B3C2D1，即輸出功率960 W，提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃，液料比15∶1。

2.3.3 超聲波提取法的正交試驗(yàn)結(jié)果 直觀分析與方差分析結(jié)果見表10。由表10可知，影響超聲波法提取腸癰Ⅱ號(hào)的主次順序?yàn)锳>C>B>D。以極差最小項(xiàng)D為誤差項(xiàng)做方差分析，由表11方差分析可見A、C因素對(duì)結(jié)果有顯著性影響。其最佳工藝為A2B2C2D2，即輸出功率800 W，提取時(shí)間70 min，提取溫度50℃，液料比25∶1。

2.4 正交試驗(yàn)分析

2.4.1 回流提取法的工藝驗(yàn)證 在相同的投樣量（14.9 g）、粒度60目、提取次數(shù)3次（合并每次提取液），A2B2C2即提取溫度60 ℃，每次提取時(shí)間2 h，液料比20∶1。平行3次試驗(yàn)驗(yàn)證此工藝，綜合平均得分為5.96，高于預(yù)試驗(yàn)、單因素及正交試驗(yàn)中任何一組結(jié)果，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4.2 微波提取法的工藝驗(yàn)證 在相同的投樣量（14.9 g）、粒度80目、提取次數(shù)3次（合并每次提取液），A2B3C2D1，即輸出功率960 W，提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃，液料比15∶1。平行3次試驗(yàn)驗(yàn)證此工藝，綜合平均得分為5.93，高于預(yù)試驗(yàn)、單因素及正交試驗(yàn)中任何一組結(jié)果，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4.3 超聲波提取法的工藝驗(yàn)證 在相同的投樣量（14.9 g）、粒度80目、提取次數(shù)3次（合并每次提取液），A2B2C2D2，即輸出功率800 W，提取時(shí)間70 min，提取溫度50 ℃，液料比25∶1。平行3次試驗(yàn)驗(yàn)證此工藝，綜合平均得分為6.12，高于預(yù)試驗(yàn)、單因素及正交試驗(yàn)中任何一組結(jié)果，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)與討論

上述結(jié)果表明，超聲波法綜合評(píng)分為6.12>回流法綜合評(píng)分為5.96>微波法綜合評(píng)分為5.93。超聲波法提取效率高、操作簡便、省時(shí)；微波法雖然操作簡便、省時(shí)，但相對(duì)提取率不高；回流提取法操作過程繁瑣、提取率不高、耗時(shí)。

另外，中草藥處理一直延續(xù)傳統(tǒng)的水煎法，但由于水煎法溫度高，會(huì)破壞有效成分，而且還存在較多雜質(zhì)。本試驗(yàn)通過腸癰Ⅱ號(hào)的工藝研究，以HPLC法檢測君藥中主成分含量，分光光度法檢測總黃酮含量，并結(jié)合總浸膏量為依據(jù)，系統(tǒng)分析了各因素對(duì)提取過程產(chǎn)生的影響，為后期復(fù)方中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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（責(zé)任編輯 周有祥）