凡納對蝦Ⅰ型溶菌酶基因的克隆與性質(zhì)研究

摘要：以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）I型溶菌酶為研究對象，克隆了I型溶菌酶基因，并進行了氨基酸序列分析、系統(tǒng)進化分析以及分子結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測，為進一步揭示溶菌酶基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；I型溶菌酶；基因克隆

中圖分類號：S917.4；Q781 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5541-02

在低等無脊椎動物體內(nèi)中，溶菌酶是一個重要的免疫反應(yīng)相關(guān)的分子。在清除細菌方面，溶菌酶主要依賴能夠水解細菌細胞壁的β-1，4-糖苷鍵，來清除入侵的細菌和異物，發(fā)揮免疫防御作用[1]。本研究以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）中發(fā)現(xiàn)的無脊椎動物Ⅰ型溶菌酶為研究對象，克隆了Ⅰ型溶菌酶基因，并進行了氨基酸序列分析、系統(tǒng)進化分析以及分子結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測，為進一步研究該基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納對蝦購自于包頭市友誼水產(chǎn)市場。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 參照使用說明書，利用TRizol總RNA提取試劑盒提取凡納對蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 目的片段的PCR擴增 根據(jù)GenBank中凡納對蝦Ⅰ型溶菌酶基因（Lva-ilys）的cDNA部分序列，設(shè)計特異性引物，以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，擴增cDNA全長序列[2]。

1.2.3 重組T載體的構(gòu)建與序列測定 目的片段回收、純化之后，克隆至pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；經(jīng)過藍白斑篩選之后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 氨基酸序列的比對 將Lva-ilys基因的cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，選擇相似性較高的分子，利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN進行氨基酸序列比對[3]。

1.3.2 系統(tǒng)進化樹的繪制 選擇物種相近的溶菌酶基因，進行氨基酸序列分析之后，利用分子生物學(xué)軟件MEGA 4.0進行系統(tǒng)進化樹的繪制[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆和序列分析結(jié)果

經(jīng)過基因克隆、序列測定之后，獲得了Lva-ilys的cDNA全長序列，序列大小為556 bp，編碼142個氨基酸，其中前17個氨基酸殘基形成信號肽結(jié)構(gòu)（圖1），從第19個至第131個氨基酸殘基形成了溶菌酶的特征結(jié)構(gòu)域——LYZ1結(jié)構(gòu)域。

2.2 氨基酸序列的同源性分析及系統(tǒng)進化樹分析

選擇與該物種相近的4種其他溶菌酶基因的氨基酸序列，進行氨基酸序列比對分析，結(jié)果表明，這些溶菌酶基因的氨基酸序列相似性程度較高，達到了75.5%。系統(tǒng)進化樹分析（圖2）表明，凡納對蝦Lva-ilys分子與波羅的海海星（Asterias rubens）溶菌酶分子（Aru-Lys）、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）溶菌酶分子（Vph-Lys）分布在一個分支上，說明它們之間的親緣關(guān)系更近一些。

2.3 Lva-ilys分子的結(jié)構(gòu)預(yù)測

凡納對蝦Lva-ilys分子屬于典型的溶菌酶分子，Lva-ilys分子中具有信號肽序列和典型的LYZ1結(jié)構(gòu)域（圖3）。結(jié)合分子的氨基酸一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Lva-ilys分子的LYZ1結(jié)構(gòu)域中存在10個半胱氨酸殘基，但是不位于保守位置，而且活性位點不明確，只存在一個“CLACMC”基序，這也可能說明Lva-ilys是一個新發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型溶菌酶分子。

3 小結(jié)與討論

本研究克隆得到的凡納對蝦Ⅰ型溶菌酶，從氨基酸一級結(jié)構(gòu)上來說，具有與其他Ⅰ型溶菌酶分子不同之處。首先，在溶菌酶結(jié)構(gòu)域中，沒有發(fā)現(xiàn)保守的活性位點，而且存在10個半胱氨酸殘基，這是Lva-ilys分子比較特異的地方，也可能說明Lva-ilys分子是一類新的Ⅰ型溶菌酶分子。其次，Lva-ilys分子與其他物種的溶菌酶分子具有較高的同源性，但是在關(guān)鍵作用的半胱氨酸殘基中保守性不高，這也可能是影響分子功能的一個重要因素，有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] MAI W J， WANG W N. Protection of blue shrimp （Litopenaeus stylirostris） against the White spot syndrome virus （WSSV） when injected with shrimp lysozyme[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（4）：727-733.

[2] DU Z Q， LI X C， WANG Z H， et al. A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkia[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C， DU X J， XU W T， et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（4）：517-524.

[4] LI X C， DU Z Q， LAN J F， et al. A novel pathogen-binding gC1qR homolog， FcgC1qR， in the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（2）：400-407.

（責(zé)任編輯 屠 晶）