紫莖澤蘭葉第四級提取物治療雞球蟲病的研究

摘要：選擇健康、體重相近的25日齡鐵腳麻雞30只隨機分為3組，第1組不作處理（空白對照組），第2、3組滴喂球蟲孢子，3 d后第2組投喂地克珠利，第3組投喂紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）第四級提取物，7 d后試驗結(jié)束，分別計算藥物抗球蟲指數(shù)，測定小雞血液丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性。此外，用質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等測定試驗藥物分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，第3組抗球蟲指數(shù)為188.67，療效達到高效。試驗藥物組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性平均值為99.88，低于空白對照組的，除腸道外其他器官未見異常癥狀，說明試驗藥物具有一定的毒性，但對雞的毒副作用較小。分子結(jié)構(gòu)測定表明試驗藥物為含有苯胺和氯的結(jié)構(gòu)復雜的脂類。

關鍵詞：紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）；提取物；治療；雞球蟲病

中圖分類號：S859 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5525-03

雞球蟲病是雞常見且危害十分嚴重的寄生蟲病，是一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。球蟲的抗藥變異性強，目前所用的抗球蟲藥物幾乎都已出現(xiàn)抗藥蟲株[1]，如今即使在用藥情況下仍可暴發(fā)球蟲病或出現(xiàn)亞臨床感染情況[2，3]，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大損失[4-6]。紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）是外來入侵植物，對動植物均有危害，難以防治[7]，已在中國南方地區(qū)廣泛蔓延[8，9]，對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重破壞[10]，已被國家環(huán)保總局列為外來有害物種[11]。為了開發(fā)利用紫莖澤蘭，本研究用其葉的第四級提取物進行雞球蟲病的治療試驗，探究紫莖澤蘭毒素對雞球蟲的抑制能力，既為治療雞球蟲病尋找新藥物，也為紫莖澤蘭的利用探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

紫莖澤蘭鮮葉采自野生植株；含球蟲卵囊雞糞采自暴發(fā)球蟲病的養(yǎng)雞場；試驗動物為25日齡鐵腳麻雞。

主要試劑：異丙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、2.5%重鉻酸鉀溶液、生理鹽水、硅膠（200～300目）、抗球蟲藥物地克珠利、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、肝素。

主要儀器：干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、培養(yǎng)箱、離心機、顯微鏡、微量移液器、色譜柱管、電子天平、半自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 紫莖澤蘭第四級提取物的制備 將紫莖澤蘭鮮葉置干燥箱內(nèi)于65 ℃中烘干，粉碎后于試劑瓶中用異丙醇浸泡5 d，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液。用硅膠柱層析法對濃縮液進行組分分離，各級洗脫液為：石油醚、石油醚︰乙酸乙酯（分5級：3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶乙醇（分3級：2∶1、1∶1、1∶2）、乙醇。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把第四級組分的洗脫液蒸發(fā)后所得即為紫莖澤蘭第四級提取物。

1.2.2 球蟲孢子囊的獲取 將球蟲病患雞糞便放入清水中攪成懸液后用棉布過濾，濾液經(jīng)離心（3 000 r/min，10 min）后棄去上清液，加清水把沉淀物攪溶后再離心，重復上述操作3次，棄去上清液后得到球蟲卵囊（含多種球蟲的）。將球蟲卵囊放入2.5%重鉻酸鉀溶液中于29 ℃中培養(yǎng)5 d，顯微鏡下觀察， 確認卵囊孵化為孢子囊后將培養(yǎng)液離心， 棄去上清液后加清水洗滌離心3次，棄去上清液， 加入適量生理鹽水得球蟲孢子囊懸液。用微量移液器吸取2 μL該懸液于載玻片上，顯微鏡下計數(shù)孢子囊數(shù)量，重復3次，用3次的平均數(shù)算出1 mL懸液中孢子囊的數(shù)量。

1.2.3 試驗分組及處理 25日齡鐵腳麻雞購進后觀察2 d，淘汰特小個體，隨機分為3組，第1組為空白對照組，第2組為對照藥物（地克珠利組），第3組為試驗藥物組（紫莖澤蘭葉第四級提取物組），每組10只，分別稱重。給第2、3組試驗雞滴喂球蟲孢子，每只的滴喂量為2萬～4萬個（根據(jù)上述計數(shù)結(jié)果確定懸液滴喂量），空白對照組不作處理。接種球蟲3 d后， 取血便于顯微鏡下檢查， 確認各試驗組雞患球蟲病后給第2組投喂?jié)舛葹?.15 mL/L地克珠利水溶液，劑量按說明書使用，第3組投喂紫莖澤蘭第四級提取物，用量為0.5 g/kg拌料使用。試驗期間正常管理，投藥7 d后將各組雞分別稱重、抽血、屠宰、解剖。

1.2.4 抗球蟲效果評判

1）相對增重率。相對增重率（%）=藥物試驗組的平均增重/空白對照組的平均增重×100

2）存活率。存活率（%）=每組終末存活數(shù)/每組初始雞只數(shù)×100

3）病變值。先根據(jù)病變的嚴重程度，用Johnson標準進行病變記分[12]，具體記分方法為：腸道壁無肉眼可見病變者記為0分；腸道壁有少量散在的淤血點、腸道壁不增厚，內(nèi)容物正常者記為1分；腸道壁有較多的淤血點、腸道內(nèi)容物明顯帶血、腸道壁增厚、盲腸內(nèi)容物正常者記為2分；腸道有較多血液或有盲腸芯（血凝塊或灰白色干酪樣塊狀物）、腸道壁明顯增厚者記為3分；腸道充滿大量血液或盲腸芯很大，致使盲腸腫大或死亡者記為4分。對每只雞分別記分后算出各組的平均病變記分，再按下式計算每組病變值。

病變值=組內(nèi)平均病變記分×10

4）平均卵囊值。取1 g腸道內(nèi)容物于10 mL水中，充分攪拌成懸液后用微量移液器吸取2 μL于載玻片上，顯微鏡下計數(shù)卵囊數(shù)量，重復3次，用3次的平均數(shù)算出1 g腸道內(nèi)容物中的卵囊數(shù)，按下式算出克卵囊數(shù)（Oocyst pergram，OPG）：

克卵囊數(shù)=1 g腸道內(nèi)容物的卵囊數(shù)×10-6

當0≤OPG<0.1時，卵囊值0；當0.1≤OPG<1時，卵囊值1；當1≤OPG<6時，卵囊值10；當6≤OPG<11時，卵囊值20；當OPG≥11時，卵囊值40。每雞單獨計算，再算出各組的平均卵囊值。

5）判定標準。用抗球蟲指數(shù)（Anticoccidial Index，ACI）作為判定藥效的指標，按以下方法計算藥物的抗球蟲指數(shù)[12]。

抗球蟲指數(shù)（ACI）=（相對增重率+存活率）-（病變值+平均卵囊值）

藥效判定標準為：ACI≥180者為高效；180> ACI≥160者為中效；160>ACI≥120者為低效；ACI <120者為無效。

1.2.5 試驗藥物毒性測定 以試驗雞血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的高低（與空白對照組相比）作為藥物毒性大小的指標。屠宰前對雞進行采血，每只采血10 mL，置于盛有肝素的試管中，輕微振蕩2 min后離心（2 000 r/min，10 min），取上清液，加入丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑，充分反應后用半自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性（以吸光度來表示，吸光度越大，活性越大）。此外，通過解剖觀察，了解試驗雞各器官組織的病變情況，以此判斷試驗藥物毒性的大小。

1.2.6 試驗藥物分子結(jié)構(gòu)測定 取試驗藥物樣品進行質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、核磁共振（NMR）H譜和C譜測定，通過測定了解其分子結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭葉第四級提取物的療效

由表1可知，即使受到球蟲的嚴重感染，第3組的相對增重率仍達91.67%，存活率為100%，這表明紫莖澤蘭葉第四級提取物對球蟲具有明顯的抑制作用。

2.2 紫莖澤蘭葉第四級提取物對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

各組小雞血液丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性的測定結(jié)果見表2。由表2可知，ALT易被有毒物質(zhì)破壞，濃度下降，活性降低。第3組ALT活性明顯低于第1組，這表明紫莖澤蘭葉第四級提取物對試驗雞有一定的毒性。

2.3 試驗藥物分子結(jié)構(gòu)

試驗藥物的分子結(jié)構(gòu)是由中國科學院昆明植物所植化分析測試中心進行測定，測定結(jié)果見圖1。

3 小結(jié)與討論

3.1 紫莖澤蘭葉第四級提取物的療效

從表1可知，第3組的抗球蟲指數(shù)略高于第2組，療效達高效，這表明試驗藥物具有較強的抗球蟲作用。從試驗過程中試驗動物的病情變化來看，投喂藥物后的第二天小雞血便現(xiàn)象消失，這也表明試驗藥物對雞球蟲有較強的抑制作用。

3.2 紫莖澤蘭葉第四級提取物的毒性

由表2可知，第3組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性比第1組低35.98%，比第2組低8.84%，從表1可知，第3組的相對增重率小于第2組，但第3組的病變值也小于第2組，說明紫莖澤蘭葉第四級提取物對試驗雞的毒副作用比地克珠利大，其抗球蟲能力也比地克珠利強。從解剖觀察結(jié)果來看，紫莖澤蘭葉第四級提取物的毒性較小，其毒副作用在試驗雞的耐受范圍之內(nèi)。

3.3 試驗藥物的分子結(jié)構(gòu)

從圖1可知，紫莖澤蘭葉第四級提取物為含有苯胺和氯的結(jié)構(gòu)復雜的脂類，因條件所限，本研究未對其抑制球蟲的作用機理進行研究，僅測定了其分子結(jié)構(gòu)，該測定結(jié)果可為紫莖澤蘭進一步開發(fā)利用的研究提供基礎資料。

綜上所述，從紫莖澤蘭葉第四級提取物對雞球蟲具有較強的抑制作用，對雞球蟲病的療效略優(yōu)于高效抗球蟲藥物地克珠利，其毒性雖稍大于地克珠利，但對試驗雞的毒副作用較輕，未對小雞機體造成大的損害。

致謝：本試驗得到云南省森林災害預警與控制重點實驗室的鼎力支持，在此表示感謝。

參考文獻：

[1] 沈克姑，田淑琴.雞球蟲抗藥性問題的解決措施[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2008（9）：36-38.

[2] 吉朝松，王天奇，董發(fā)明，等.托曲珠利抗柔嫩艾美耳球蟲洛陽分離株的效果研究[J].河南畜牧獸醫(yī)，2008，29（2）：5-7.

[3] 劉高生，盧升云.雞球蟲病的防治[J].中國家禽，2004，26（11）：30-32.

[4] BIGGSP M. The world disease of poultry disease[J].Avian Pathology，1982（11）：281-300.

[5] 李艷琴，王振海，秦建華，等.雞球蟲病免疫防治研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（13）：5438-5440.

[6] BHOGAL B S. Potential of recombinant antigen as a prophylactic vaccine forone-day-old broiler chickens against E.acervuline and E. tenllainfections[J].Vet Immun Immunopath，1992（31）：323-335.

[7] 羅 強，張 薇，李立娜.紫莖澤蘭的生物入侵及利用現(xiàn)狀[J].西昌農(nóng)業(yè)高等專科學校學報，2004（2）：9-11.

[8] 孟秀祥，馮金朝，周宜君，等.四川西南紫莖澤蘭入侵生境因子分析[J].中央民族大學學報（自然科學版），2003，12（4）：293-295.

[9] 賀俊英，強 勝，宋小玲，等.外來植物紫莖澤蘭18個種群的莖葉形態(tài)結(jié)構(gòu)比較研究[J].西北植物學報，2005，25（6）：1089-1095.

[10] 賈桂康，梁云貞.紫莖澤蘭對生態(tài)系統(tǒng)的危害和防除[J].廣西植保，2005，18（1）：18-21.

[11] 李 麗，張無敵，尹 芳.紫莖澤蘭的各種利用研究[J].農(nóng)業(yè)技術，2007，27（4）：51-54.

[12] 許金俊.動物寄生蟲病學實驗教程[M].南京：河海大學出版社，2007.

（責任編輯 程碧軍）