湖北省梨地方資源遺傳變異和親緣關(guān)系的SSR分析

摘要：采用9對SSR特異性引物對湖北省92個梨品種（類型）的遺傳變異和親緣關(guān)系進行了分析。結(jié)果表明，9對引物共擴增出71個等位基因，不同引物擴增的等位基因差異較大，從5個到12個不等，平均每個位點7.9個等位基因。位點雜合度在0.616～0.868之間，平均值為0.788；Shannon-Weaver指數(shù)在1.690 2～2.964 4 之間。采用UPGMA聚類分析法構(gòu)建的系統(tǒng)樹將92個梨品種劃分為5組：白梨組、砂梨組、雜交類、豆梨組和半野生組。SSR分析結(jié)果說明湖北省梨地方資源具有豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：梨；種質(zhì)資源；遺傳變異；親緣關(guān)系；SSR；湖北省

中圖分類號：S661.2；S-3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5496-06

湖北省是中國梨屬（Pyrus L.）植物的主要原產(chǎn)地之一，也是砂梨的重要產(chǎn)地。由于湖北省內(nèi)自然條件和生態(tài)條件復(fù)雜多樣，地貌類型多，加之梨屬植物種間沒有雜交障礙，在長期的自然演變和栽培馴化過程中，形成了極為豐富的地方品種、栽培類型和野生變異類型。據(jù)不完全統(tǒng)計，湖北省梨地方品種和栽培類型的數(shù)量超過300個。國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃共收集保存了92份湖北省梨地方資源，從形態(tài)學(xué)上鑒別這些資源可能存在同名異物、同物異名現(xiàn)象，且品種之間的遺傳背景和親緣關(guān)系至今仍不清楚，在一定程度上限制了湖北省梨種質(zhì)資源的認識和利用。

以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為梨品種鑒定、親緣關(guān)系等遺傳分析提供了有力的手段[1]。SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記因其豐富的多態(tài)性、共顯性遺傳、重復(fù)性好和操作簡便等優(yōu)點日益受到重視，也適合梨品種的遺傳分析[2，3]。Kimura等[4]采用9對SSR引物分析了60個梨品種和類型的遺傳多樣性，同時鑒別出2個同物異名和2個同名異物品種。Brini等[5]利用SSR引物對25份突尼斯地方梨品種進行了遺傳多樣性分析，為這些地方品種的保存提供了理論依據(jù)。Bao等[6]利用SSR標(biāo)記對98份東亞梨品種進行了親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究；路娟等[7]采用25對SSR引物對不同系統(tǒng)的150份梨資源進行了系統(tǒng)分析。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析了湖北省梨地方資源的遺傳變異和親緣關(guān)系，為湖北省梨屬植物資源的進一步搜集、保存、開發(fā)利用和遺傳育種提供科學(xué)指導(dǎo)，從而為湖北省梨種質(zhì)資源保護和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試92份梨種質(zhì)資源來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所的國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃。材料編號、品種名稱及來源地見表1。92份材料原產(chǎn)地來自于12個縣（市），其中興山27份、荊門20份、武漢8份、羅田7份、咸豐7份、遠安6份、巴東4份、長陽4份、建始3份、宣恩3份、利川2份、鶴峰1份。來源地經(jīng)度分布為108°93′E-115°39′E，緯度分布為29°68′N-31°23′N。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 摘取春季萌發(fā)的梨嫩葉，采用改良的CTAB法提取DNA[8，9]，并結(jié)合供試材料及試驗條件略作改進。提取結(jié)束后，用分光光度計測定DNA濃度并將其調(diào)整為10 μg/μL。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系 所用9對SSR引物均為多態(tài)性好且分辨率高的引物，由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中1、2號引物是Liebhard等[10]在蘋果上開發(fā)的，3～9號引物是Yamamoto等[11]在梨屬植物上開發(fā)的。具體引物序列見表2。

參考Yamamoto等[12]、Gianfranceschi等[13]的方法，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，其中包括模板DNA 2.0 μL、引物2×0.4 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.4 μL，PCR Buffer 2.0 μL，ddH2O 14.6 μL。

引物CH01F02、CH01H10擴增程序為：94 ℃預(yù)變性2.5 min； 94 ℃變性0.5 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。引物NH004a、NH005b、NH008b、NH009b、NH011b、NH015a、NH017a擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測 PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，采用AgNO3染色法進行染色[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 根據(jù)DNA條帶位置的不同，以“1”和“0”分別代表條帶的有和無，記錄每個SSR位點中清晰的條帶。電泳條帶按1/0進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，生成0和1組成的原始矩陣。根據(jù)以下公式計算位點雜合度（h）和遺傳多樣指數(shù)（H）。

h=1-∑Xi2

H=∑h/n

式中Xi表示第i個等位基因的頻率。用NTSYS-pc Version 2.1軟件[15]進行數(shù)據(jù)分析，Simqual程序計算SM相似系數(shù)矩陣，用SHAN程序中的UPGMA（Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Averages）法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖北省梨地方資源的SSR位點特征

9對SSR引物均能產(chǎn)生較多的差異性位點，對92個梨品種進行擴增，共獲71個等位基因，不同引物擴增的等位基因數(shù)差異較大，從5個到12個不等，平均每個位點7.9個等位基因。其中以NH015a引物產(chǎn)生的位點數(shù)最多，NH005b引物產(chǎn)生的位點數(shù)最少。9對引物擴增位點雜合度在0.616～0.868之間，平均值為0.788；Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)在1.690 2～2.964 4之間，平均為2.573 6；位點雜合度和Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)均最高的引物為NH004a（表3）。圖1、圖2分別為引物NH015a、NH008b對92個梨品種的PCR擴增產(chǎn)物6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

2.2 品種鑒別

9對SSR引物除對大把梨、半斤梨、興山14號與興山秤砣梨（1）4個品種未區(qū)分開外，對其余88個品種均可區(qū)分開。大把梨和半斤梨都來源于荊門，且果實為圓形或長圓形，果皮綠色，萼片脫落，萼洼隆起，一年生枝條為灰褐色，葉片卵圓形，葉基寬楔形，葉尖急尖，銳鋸齒。形態(tài)學(xué)性狀相似性很高，可能為同物異名。興山14號和興山秤砣梨（1）都來源于興山，果實圓形，果皮綠色，萼片脫落，葉片卵圓形，葉尖急尖，銳鋸齒。形態(tài)學(xué)性狀相似性較高，可能為同物異名。所以，大把梨與半斤梨、興山14號與興山秤砣梨（1）可能為2對同物異名品種。

來源于荊門的望水白和來源于遠安的望水白，來源于武漢的猴咀和來源于荊門的猴嘴，來源于建始、咸豐、宣恩的秤砣梨，長陽芝麻梨與興山芝麻梨、巴東桐子梨與興山桐子梨等雖然品種名稱一樣，但等位基因不一樣，為同名異物。

來源于荊門的無名2與香水梨2個品種，果形均為葫蘆形，果皮為綠色，果面蓋色為鮮紅色，部分著色。葉片均為卵圓形，葉基寬楔。植物學(xué)特征非常相似，根據(jù)形態(tài)學(xué)很難區(qū)分這2個品種。但SSR分析結(jié)果表明2個品種等位基因不一樣，可以成功區(qū)分。兩個品種相似性較高，相似系數(shù)為0.875。

2.3 湖北省梨地方資源遺傳變異及親緣關(guān)系分析

由NTSYS-PC Version 2.1軟件計算92份試材間的相似系數(shù)。92份梨種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.625～1.000。為了闡明梨品種的親緣關(guān)系，采用UPGMA方法對92份種質(zhì)資源進行了系統(tǒng)聚類，構(gòu)建了系統(tǒng)關(guān)系樹。分析表明，在相似系數(shù)為0.701 1處，92份種質(zhì)資源可分為5個大組（圖3）。

第一組劃分為白梨組。由鶴峰雪花梨、半斤梨、大把梨、青皮梨等10個品種組成。這一組果實果皮大多為綠色，果實圓形或長圓形。其中來源于荊門3個、興山2個、羅田1個、長陽1個、鶴峰1個、武漢1個、巴東1個。鶴峰雪花梨和半斤梨、大把梨首先聚在一起，然后與青皮梨聚類，再和猴咀聚類，最后和興山芝麻梨、羅田麻殼梨聚為一組。這一組品種與其他組品種可明顯區(qū)分開來。

第二組劃分為砂梨組，由75個品種組成。這75個品種可明顯劃分為8個亞組。

第一亞組由利川香水、巴東桐子梨、羅田長柄梨、興山秤砣梨（2）等10個品種組成。其中來源于興山4個、羅田3個、利川2個、巴東1個。利川香水與巴東桐子梨先聚為一類，再與羅田長柄梨聚合，再與興山秤砣梨（2）聚合，然后與利川玉川聚合，再與興山3號、羅田秤砣梨、羅田冬梨、興山8號、興山7號聚為一個亞組。從地理分布來看，興山、利川、巴東等地理位置相距較近，但均與羅田相距較遠。

第二亞組由十里香、朵朵花、興山糖梨子、興山瓜兒梨等10個品種組成。在這10個品種中，來源于興山3個、遠安3個、荊門2個、武漢2個。

第三亞組由宣恩雪梨、宣恩楊洞梨、咸豐白結(jié)、興山石滾梨、咸豐楊洞梨等12個品種組成。這12個品種中，來源于興山3個、咸豐3個、宣恩2個、荊門1個、巴東1個、武漢1個、長陽1個。

第四亞組由宣恩秤砣梨、興山13號、秋里白、甜棠梗子、麻棠梗子等31個品種組成。在這31個品種中，來源于荊門11個、興山7個、建始3個、遠安2個、咸豐2個、長陽2個、武漢2個、巴東1個、宣恩1個。

第五亞組由龍團梨、興山14號、興山秤砣梨（1）、興山12號、羅田冷水梨、羅田酸梨、羅田短柄梨等7個品種組成。其中來源興山3個、羅田3個、遠安1個。雖然羅田與興山地理位置相距較遠，但兩地的地方品種遺傳距離較近。

第六亞組由咸豐80-1和安寧梨2個品種組成。其中來源于咸豐1個、武漢1個。安寧梨平均單果重225.3 g，果實圓形，果皮黃綠色，果肉粗，肉質(zhì)緊密，石細胞多，萼片宿存。咸豐80-1平均單果重271.2 g，果實葫蘆形，果皮黃綠色，萼片脫落。

第七亞組由興山11號1個品種組成。興山11號原產(chǎn)于興山縣，果實為葫蘆形，果皮褐色，果特大，平均單果重493.9 g，萼片脫落。

第八亞組由咸豐秤砣梨、興山麻梨組成。咸豐秤砣梨原產(chǎn)于咸豐，興山麻梨原產(chǎn)于興山。興山麻梨果實很小，平均單果重22.4 g，果實長圓形，果皮褐色，肉質(zhì)極粗，肉質(zhì)緊密，萼片脫落，梗洼極淺，石細胞極多，汁液少。葉片圓形，葉基楔形，葉尖長、尾尖。咸豐秤砣梨平均單果重120.4 g，果實倒卵形，果皮綠色，萼片殘存，果心大，肉質(zhì)緊密，石細胞多，汁液中等。

從8個亞組品種組成來看，11個原產(chǎn)地的品種交錯聚類，說明湖北省梨地方品種間遺傳背景較復(fù)雜。

第三組劃分為雜交類，由興山柴梨、興山36號、大茶梨3個品種組成。其中興山柴梨、興山36號來源于興山，大茶梨來源于荊門。說明興山和荊門的梨品種親緣關(guān)系較近。興山柴梨幼葉淡綠色，葉片卵圓形，葉基寬楔形，葉尖急尖。平均單果重22.4 g，果實圓形，果皮綠色，萼片脫落。興山36號平均單果重85.0 g，果實圓形，果皮綠色，萼片脫落，葉片卵圓形，葉基寬楔形，葉尖急尖。大茶梨平均單果重211.5 g，果實長圓形，果皮褐色，萼片脫落，葉片卵圓形，葉基寬楔形，葉尖急尖。3個品種植物學(xué)性狀也近似，果形為圓形或長圓形，果實萼片均脫落，葉片卵圓形，葉基寬楔形，葉尖急尖。

第四組劃分為豆梨組。由武豆2號、荊豆11號和興山1號3個品種組成。武豆2號與荊豆11號先聚為一類，再與興山1號聚為一組。來源于武漢的武豆2號和來源于荊門的荊豆11號雖然來源地不同，但均屬于豆梨（Pyrus calleryana Dcne），2個品種間遺傳相似系數(shù)為0.843 8，兩者之間遺傳距離較近。而興山1號為砂梨品種，說明興山1號與豆梨遺傳距離較近。興山1號果實很小，平均單果重54.9 g，果實圓形，果皮綠色，萼片脫落。且武豆2號、荊豆11號果實均為圓形，萼片脫落。

第五組劃分為半野生組，由白棠梗子1個品種構(gòu)成。來源于荊門，形態(tài)特征較為獨特，單獨聚為一類，說明其與砂梨、豆梨的遺傳距離較遠。白棠梗子形態(tài)也較為特別，果實很小，平均單果重為41.8 g，果實扁圓形，果皮黃褐色，萼片脫落，4～5心室，果心較大，果實商品價值不高。

從以上聚類結(jié)果可看出，來源于荊門和興山的地方品種較為獨特，來源于荊門和興山的有部分品種單獨聚類，且兩地區(qū)的品種相互交錯聚類。這說明荊門和興山的地方品種類型豐富，品種獨特，遺傳背景比其他地區(qū)復(fù)雜。

3 小結(jié)與討論

3.1 SSR鑒別品種的有效性

9對SSR引物未能將大把梨與半斤梨，興山14號與興山秤砣梨（1）這2對形態(tài)學(xué)非常相近的4個品種區(qū)分開，但成功區(qū)分了形態(tài)學(xué)相近的2個品種荊門無名2和香水梨，區(qū)分了望水白、猴嘴、秤砣梨、芝麻梨等同名異物品種。這充分證實了SSR標(biāo)記鑒別梨品種的有效性。2對形態(tài)學(xué)相近且SSR標(biāo)記未能區(qū)分開的品種可能為同物異名資源，還需要進一步增加SSR標(biāo)記數(shù)量進行確認。

3.2 聚類分析

聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果大體一致，即基本上是以種為基礎(chǔ)聚合成5組：白梨組、砂梨組、雜交類、豆梨組和半野生組。根據(jù)形態(tài)特征無法確定歸宿的梨種質(zhì)資源甜棠梗子、麻棠梗子均與砂梨顯示了較近的親緣關(guān)系，與砂梨聚為一類；白棠梗子單獨聚為一類，其形態(tài)學(xué)特征也較獨特，可能為梨的半野生類型。

興山柴梨、興山36號、大茶梨等3個品種聚為一組。而興山柴梨與興山36號均來源于興山，大茶梨來源于荊門，來源地不同。推測這3個品種可能為復(fù)雜的雜交類型。由于試材條件限制，本研究中種的資源較少，為了進一步弄清楚3個品種的種類，還需要引入其他種的梨資源進行比較分析。

3.3 等位基因數(shù)與雜合度

等位基因數(shù)的多少和雜合度的高低是反映所用SSR位點鑒別植物基因型能力的重要指標(biāo)[16]。本研究中所檢測的9對SSR引物共擴增出71個等位基因，每個位點的平均等位基因數(shù)為7.9，少于栽培品種[17]和甘肅梨[14]的9.5、8.8，可能與本研究所檢測的材料數(shù)量少、所采集材料的地理范圍窄有關(guān)。本研究供試材料主要集中在興山、荊門以及鄂西地區(qū)，而鄂北、鄂南地區(qū)樣較少。各位點的平均位點雜合度、Shannon-Weaver指數(shù)顯示了湖北省梨屬植物豐富的遺傳變異。

3.4 湖北省梨地方資源多樣性

SSR標(biāo)記成功分析了湖北省的梨地方品種的遺傳變異和親緣關(guān)系，選用的9對SSR特異引物擴增出豐富的多態(tài)性條帶，具有較高的鑒別能力，位點雜合度、Shannon-Weaver遺傳多樣性指數(shù)等分析揭示了湖北省梨種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。研究結(jié)果為湖北省梨資源進一步分類和利用提供了依據(jù)。

3.5 存在問題及展望

本研究采用SSR標(biāo)記對湖北省92個梨地方品種進行了遺傳多樣性評價和親緣關(guān)系分析。包括了12個縣市的部分種質(zhì)資源，來源于鄂北地區(qū)的梨資源基本沒有，這可能會低估了湖北省梨種質(zhì)資源居群內(nèi)和居群間的遺傳多樣性水平。因此要全面研究湖北省梨種質(zhì)資源遺傳多樣性還需要進一步擴大地方梨種質(zhì)資源的樣品，借助其他的DNA標(biāo)記技術(shù)同時結(jié)合形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)等技術(shù)，從多角度、多層面系統(tǒng)研究地方品種的遺傳關(guān)系，并與周邊省市的梨資源進行比較分析，從而為正確評價湖北省梨地方資源、種質(zhì)資源創(chuàng)新和育種實踐提供理論支持。此外，雖然湖北省梨地方品種資源非常豐富，但隨著人類活動和自然環(huán)境的影響，很多珍貴的類型正逐步減少甚至滅絕，因此對湖北省梨種質(zhì)資源進行廣泛而有效地收集、保護、評價和利用已成為一個比較緊迫的任務(wù)。所以需要進一步加強湖北省內(nèi)梨種質(zhì)資源的調(diào)查、搜集，特別要加強野生和半野生珍稀瀕危資源的收集，同時開展國內(nèi)外特異砂梨資源的廣泛收集和引種，為梨種質(zhì)資源利用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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