滅多威對家蠅胚胎細(xì)胞系細(xì)胞色素C及Caspase 3的影響

摘要：為尋找家蠅防治新靶點提供新的思路，研究滅多威作用于家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114細(xì)胞后對細(xì)胞色素C和Caspase 3的影響。用4 mg/mL滅多威干預(yù)MDEC-07114后，分別于加藥后2、6、12、24 h收集細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞色素C和Caspase 3的表達。結(jié)果表明，細(xì)胞色素C隨作用時間的延長釋放增多，Caspase 3隨作用時間的延長活性增強。根據(jù)試驗結(jié)果，推測滅多威可能是通過損傷線粒體膜，引起細(xì)胞色素C的釋放，進而激活Caspase 3，發(fā)生蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致MDEC-07114細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：家蠅胚胎細(xì)胞系；MDEC-07114細(xì)胞；滅多威；細(xì)胞色素C；Caspase 3

中圖分類號：Q965.9 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5482-03

昆蟲細(xì)胞凋亡途徑，尤其是類似哺乳動物細(xì)胞的線粒體途徑中細(xì)胞色素C（CytC）的釋放，在不同昆蟲的研究中結(jié)論有所不同[1-5]。MDEC-07114是遵義醫(yī)學(xué)院自建的家蠅胚胎細(xì)胞系，滅多威為常用氨基甲酸酯類殺蟲劑。前期研究表明滅多威可以誘導(dǎo)MDEC-07114細(xì)胞凋亡，并且引起線粒體變化[6]。本試驗擬研究滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后對細(xì)胞色素C和Caspase 3的影響，探討線粒體途徑在MDEC-07114細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)胞

家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114，由遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 M3培養(yǎng)基，Sigma公司生產(chǎn)，S3652型；胎牛血清，杭州四季青生物工程研究所生產(chǎn)；99.9%滅多威，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院生產(chǎn)；PVDF膜，Millipore公司生產(chǎn)；蛋白預(yù)染Marker、RIPA裂解液，碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2.2 主要儀器 Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽，美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；SP-9型電轉(zhuǎn)儀，大連競邁科技有限公司生產(chǎn)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 MDEC-07114細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮凍存的MDEC-07114復(fù)蘇傳代，28 ℃ 5% CO2孵育箱中培養(yǎng)[7]，待生長穩(wěn)定后進行試驗。

1.3.2 試驗分組 處理組為4 mg/mL滅多威組，對照組為等量的培養(yǎng)基。分別于加藥后2、6、12、24 h收集細(xì)胞。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測CytC、Capase 3 收集細(xì)胞，PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min獲得總蛋白；用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。每孔上40 μg總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓100 V恒壓，15 min；120 V恒壓，90 min。電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)印90 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入封閉液4 ℃封閉過夜；PBS清洗3次，每次5 min；加入一抗，室溫孵育2 h；PBST清洗3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，每次5 min。X光壓片顯影，Odyssey遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃膜，讀取OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，SPSS軟件包輔助處理，單因素方差分析，t檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CytC水平的變化

滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后對CytC的影響見圖1、圖2。4 mg/mL滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后，CytC水平隨時間的延長逐漸增加，與對照組差異顯著。說明隨作用時間的延長，CytC釋放增加。

2.2 Capase 3活性變化

滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后對Caspase 3的影響見圖3、圖4。Western blot檢測結(jié)果顯示，4 mg/mL滅多威作用于MDEC-07114后，Caspase 3活性隨作用時間延長逐漸增加，與對照組差異顯著。

3 小結(jié)與討論

對哺乳動物中線粒體信號途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機制研究認(rèn)為，線粒體在凋亡過程中可能起著中心調(diào)控作用，可通過釋放CytC導(dǎo)致凋亡發(fā)生[8]。正常情況下CytC位于線粒體內(nèi)、外膜之間，凋亡刺激物可引起CytC從線粒體易位釋放入胞漿，并與胞漿中的凋亡蛋白水解酶活化因子（Apaf-1）結(jié)合形成CytC/Apaf-1復(fù)合物，激活Caspase 9，活化的Caspase 9激活Caspase 3，從而啟動了Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡發(fā)生[9]。而在有關(guān)果蠅細(xì)胞凋亡的研究報道中，不同細(xì)胞的凋亡過程CytC的作用有所不同。在果蠅的胚胎細(xì)胞和精子的凋亡過程中，CytC發(fā)揮著重要的作用[10，11]，而在果蠅S2和BG2細(xì)胞系的凋亡過程中，CytC并未從線粒體中釋放，未參與凋亡體的形成[12，13]。關(guān)于家蠅細(xì)胞凋亡途徑的研究鮮有報道。本研究用滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞，Western Blot檢測顯示細(xì)胞色素C隨作用時間的延長釋放增多，Caspase 3隨作用時間的延長其活性增強。

前期研究發(fā)現(xiàn)，滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后，可引起線粒體結(jié)構(gòu)改變，線粒體膜電位降低。由此推測，滅多威誘導(dǎo)家蠅細(xì)胞凋亡可能是通過損傷線粒體膜，引起細(xì)胞色素C的釋放，進而激活Caspase 3，啟動Caspase細(xì)胞凋亡通路，進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

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（責(zé)任編輯 陳 焰）