葉綠素熒光動力學及在植物抗逆生理研究中的應(yīng)用

摘要：光合作用是高等植物從外界環(huán)境獲取能量的惟一途徑，是高等植物進行生命活動的基礎(chǔ)，也是整個生物界賴以生存的基礎(chǔ)，所以對光合作用的研究有著非常重要的意義。葉綠素熒光技術(shù)被稱作光合作用的研究探針，具有快速、無損傷、方便快捷等優(yōu)點，所以應(yīng)用葉綠素熒光技術(shù)來研究光合作用是最佳選擇。近年來，隨著葉綠素熒光技術(shù)的日趨成熟，如激光誘導熒光和葉綠素熒光成像技術(shù)等的應(yīng)用，葉綠素熒光技術(shù)在植物的光合作用以及植物的逆境、脅迫、病理等方面的研究日益深入；在果實的品質(zhì)數(shù)量評估方面也有應(yīng)用，甚至一部分已經(jīng)在自動化園藝產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。介紹了國內(nèi)外關(guān)于葉綠素熒光技術(shù)在園藝方面的科研成果及應(yīng)用，并討論了目前葉綠素熒光技術(shù)發(fā)展的不足之處。

關(guān)鍵詞：葉綠素熒光；園藝；激光誘導熒光；葉綠素熒光成像

中圖分類號：Q945.78；Q945.11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5399-04

1 葉綠素熒光簡介

熒光誘導現(xiàn)象最開始是在1931年由Kautsky 和Hirsch發(fā)現(xiàn)的。他們發(fā)現(xiàn)葉綠素的酒精（或乙醚）溶液在透射光下為翠綠色，反射光下為棕紅色，這就是最簡單的熒光現(xiàn)象。實際上，熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；一旦入射光停止，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。葉綠素熒光現(xiàn)象是由于葉綠素分子吸收光子以后其分子能級發(fā)生了變化，由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，當分子退激發(fā)回到基態(tài)的時候，就會釋放出一定的光子，即葉綠素熒光[1]。近年來，熒光檢測技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。隨著研究的日益深入，人們也逐漸認識到葉綠素熒光中蘊藏著豐富的生物信息，研究熒光動力學曲線可以反映出植物的生存狀態(tài)、脅迫、病理等多種信息[2]。葉綠素熒光無論是在宏觀上研究葉片和植物，還是在微觀上研究細胞和葉綠體，都起著非常重要的作用[3，4]。脈沖振幅調(diào)節(jié)熒光儀PAM，是目前應(yīng)用最廣泛的一種熒光測試儀。通常它使用可見光作為熒光的激勵源，可測光譜范圍是705～740 nm[5]。主要應(yīng)用3種光源，分別是調(diào)制脈沖誘導熒光、激光誘導熒光、日光誘導熒光[6]。其中有5個關(guān)鍵的熒光參數(shù)，分別是F0、F0′、Fm、Fm′和Fs。其中，F(xiàn)0和Fm是經(jīng)過暗適應(yīng)后的最小和最大熒光值，F(xiàn)0′和Fm′是最小和最大熒光值，F(xiàn)s是熒光的穩(wěn)定值。其他的熒光參數(shù)都是從這5個參數(shù)推導出來的，比如光學淬滅qP、非光學淬滅NPQ、PSⅡ能量轉(zhuǎn)換的量子效率ФPSⅡ等。本研究就熒光動力學在園藝方面的應(yīng)用，將主要闡述作物培養(yǎng)期一些常見的脅迫檢測。

2 作物培養(yǎng)期的非生物脅迫檢測

2.1 營養(yǎng)脅迫

Chaerle等[7]的研究表明，葉綠素熒光參數(shù)能很好地表現(xiàn)出營養(yǎng)脅迫，并以此來確認作物最佳的生長狀態(tài)，避免缺肥或過度的施肥。研究主要集中在氮肥的吸收上，因為氮是植物吸收最多的元素。事實上葉片中50%～80%的氮都參與了光合作用[8]。在不同生育期，小麥葉片氮含量與葉綠素熒光參數(shù)間差異較大。在生長旺盛的拔節(jié)期至開花期相關(guān)性較好，孕穗期Fv、Fv/Fm和Fv/Fo相關(guān)系數(shù)分別為0.647、0.788和0.812，開花期過后其相關(guān)系數(shù)降低[9]。

2.2 水分脅迫

水資源是作物產(chǎn)能的最重要的限制因素。高等植物的水脅迫發(fā)生時，在短期可以導致葉片的氣孔關(guān)閉，從而降低光合作用。在研究番茄的水脅迫時發(fā)現(xiàn)，輕度的水分脅迫對番茄幼苗熒光參數(shù)有一定的促進作用，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，NPQ變化不明顯，qL明顯上升，隨著水分脅迫時間的持續(xù)，F(xiàn)v/Fm有所回升，NPQ略高于對照，qL達到最低值，表現(xiàn)出植物對逆境的調(diào)節(jié)適應(yīng)能力。重度脅迫時，F(xiàn)v/Fm明顯低于對照，NPQ達到最高值，qL有所回升，都無法恢復(fù)到對照水平，說明重度的水分脅迫使PSⅡ遭到了破壞。所以在初期參數(shù)有變化時，能夠較早地識別出水脅迫，有助于最佳灌溉管理[10]。豆類植物葉片不同部位的光合能力梯度也可以被測量，研究表明隨著水脅迫逐漸增加，RFd（RFd=Fd/Fs=（Fm-Fs）/Fs）和Fm/Fs值下降。

2.3 溫度脅迫

極端溫度會影響作物的生長和產(chǎn)量，所以有必要知道每種作物的最佳生長溫度范圍。葉綠素熒光技術(shù)可以檢測出葉綠體對溫度變化的反應(yīng)。在高溫下，CO2的吸收和電子的傳送逐漸被抑制，F(xiàn)o增加，F(xiàn)m和Fv/Fm由于PSⅡ活性的降低而降低。輕微的熱脅迫會導致PSⅡ活性下調(diào)并啟動光保護系統(tǒng)，較強的熱脅迫會抑制保護系統(tǒng)[11]。在研究高溫脅迫對水稻的影響時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫脅迫，水稻的熒光參數(shù)和凈光合速率均不同程度降低。高溫處理5 d后，在常溫下恢復(fù)2 d，上述參數(shù)有所回升，但與常溫組相比仍有所下降。隨著脅迫溫度的升高和天數(shù)的延長，上述指標下降幅度有增大趨勢[12]。結(jié)果表明，高溫脅迫抑制PSⅡ潛在活性和凈光合速率，阻止同化力的形成，阻礙循環(huán)式光合電子傳遞。

2.4 光脅迫

雖然光照是植物生長的必要條件，但是過度的光照對植物是有害的。基于植物對光的可吸收程度，適當?shù)卦趶姽鈺r遮擋和弱光時補光，能有效地提高作物產(chǎn)量。紫外線照射對植物傷害極大，會損失一定量的核苷酸、蛋白質(zhì)和脂肪[13]。葉綠素熒光成像技術(shù)可以在光照損壞植物細胞之前做出預(yù)警。盡管不同的品種由于紫外線而產(chǎn)生的損傷不盡相同，葉綠素熒光成像技術(shù)還是可以測量出它們的差異[14]。此外，光子通量密度對于某一個單獨的植物來說是不是過度的，取決于它的生理狀態(tài)，因為當幾種環(huán)境脅迫同時發(fā)生時，光脅迫的臨界值也會發(fā)生變化[11]。

弱光環(huán)境往往伴隨著低溫，很多研究弱光或者低溫情況的時候都是一同進行。在研究棉花的低溫弱光脅迫時發(fā)現(xiàn)，棉花葉片F(xiàn)o升高，F(xiàn)v/Fm下降，表明在低溫弱光脅迫下，色素吸收的能量中用于光化學部分的比例減少，用于熱耗散和葉綠素熒光的能量增加，PSⅡ潛在活性中心受損，光合電子傳遞過程受抑，光合機構(gòu)可能遭受損害，不利于棉花葉片把所捕獲的光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能；而ФPSⅡ、Fv′/Fm′和ETR下降，表明低溫弱光脅迫致使棉花幼苗葉片PSⅡ反應(yīng)中心隨著脅迫時間的延長而逐漸關(guān)閉，天線色素光能傳遞效率逐步下降[15]。

2.5 農(nóng)藥脅迫

農(nóng)藥的使用會直接或者間接地影響作物的新陳代謝和光合作用的活性，這樣熒光的產(chǎn)量就會發(fā)生變化。這種變化可以在葉片發(fā)生明顯的變化之前檢測到[16]。事實上農(nóng)藥滲透到葉片里面很容易被熒光技術(shù)檢測到。葉片對農(nóng)藥的抑制從中脈開始，葉面上光合作用的活性差異有很強的空間異質(zhì)性，因此熒光技術(shù)可以用來檢測農(nóng)藥的效果。利谷?。↙inuron）是廣泛被用來控制多年生野草和闊葉野草的藥品。這些藥物堵塞了PSⅡ中光電子的轉(zhuǎn)移。這使得在某些植物中會促進葉綠素熒光產(chǎn)量明顯增多，從而在一些可視癥狀出現(xiàn)之前用熒光技術(shù)檢測到[17]。在對玉米的研究中，在使用敵草隆4 min后，葉片受到的影響可以用熒光成像直觀地觀察到，這種影響在30 min以后會變得更加強烈，而Fv/Fm大約降低40%[18]。相反，在對豆類植物使用敵草隆后，大約需要2.5 h后熒光產(chǎn)量才顯著增加。

2.6 空氣污染

在城市和工業(yè)地區(qū)，臭氧（O3）是主要的空氣污染。臭氧會導致植物光合作用降低，改變氣孔的導通率，導致早衰、葉片損傷以及改變?nèi)~內(nèi)抗氧化酶水平[19]。減少空氣中的臭氧是有必要的，但從短期來看，更有效的做法是培養(yǎng)抗臭氧的植物品種。對豆類植物的研究表明細胞主要的損傷發(fā)生在葉片表面氣孔周圍的柱狀薄壁組織。在這些區(qū)域附近可以測量得到ФPSⅡ和Fv/Fm下降，F(xiàn)o上升。從而得到臭氧通過氣孔滲透到葉子里并只對氣孔附近的細胞有損害[20]。對向日葵的研究中同樣觀察到了受損細胞，但是發(fā)生在表皮細胞，并且與氣孔位置無關(guān)[21]。除了臭氧以外，還有很多空氣污染，比如由煤和汽油燃燒產(chǎn)生的SO2。最早應(yīng)用熒光技術(shù)研究SO2對植物影響的是1987年對向日葵的研究[4]。無論是SO2污染還是從SO2污染的恢復(fù)過程中，都會導致葉面的熒光產(chǎn)量的異質(zhì)性。葉片中脈附近更抵抗SO2，附近的氣孔導通率更低，從而減少對SO2的吸收。

3 作物培養(yǎng)期的生物脅迫檢測

生物脅迫一般是由蟲害或者病原體引起的，從而影響熒光產(chǎn)量。最早應(yīng)用熒光技術(shù)檢測病害的是1995年對豆類植物菜豆銹?。║romyces appendiculatus）的研究[22]和1994年對黃瓜花葉?。–ucumber mosaic）的研究[23]。最早把成像與ФPSⅡ和qN聯(lián)系起來的是1996年對燕麥感染禾草冠銹?。–rown rust）的研究。禾草冠銹病發(fā)病區(qū)域不連續(xù)，并持續(xù)擴散。這些發(fā)病區(qū)域光合作用的異質(zhì)性明顯。在接種5 d后，發(fā)病區(qū)的ФPSⅡ略微下降，同時由于對ATP的需求量提高，整個葉片的qN顯著降低。該病對葉片的局部區(qū)域光合作用有很強的抑制作用[24]。當番茄被葡萄孢菌感染24 h后，光合作用活性被抑制[25]。Fv/Fm的圖像表明，葉片感染區(qū)域附近的光反應(yīng)最大量子產(chǎn)量略微減少，然而葉片的其他部分NPQ降低，其他值無變化。無病癥的成熟葉片和接種過的葉片有著非常典型的時變NPQ圖像。被病原菌入侵的區(qū)域NPQ值升高，而在周圍則有降低，說明在未感染區(qū)域光合作用能力有所提高。在感染的最后階段，由于衰老過程導致光合作用失調(diào)而鈍化，所以NPQ下降，因此NPQ對此類病毒有著非常明顯的指示作用[26]。大多數(shù)的研究都表明發(fā)病區(qū)和無病區(qū)有著明顯的熒光產(chǎn)量區(qū)別。也有研究葉綠素熒光光譜的發(fā)射不同來反映植物病態(tài)情況的研究，黃瓜的白粉病害和蚜蟲病害與健康的葉片發(fā)射的熒光主峰分別是684.197～685.749 nm、685.019～685.620 nm、682.135～685.326 nm，可以看出明顯的區(qū)別[27]。此研究如果能在病害出現(xiàn)之前即可測出就更有意義了。

4 結(jié)論和前景

本研究探討了葉綠素熒光技術(shù)在園藝方面巨大的作用和潛力。這種技術(shù)已經(jīng)成功地被許多研究方向所應(yīng)用，如收獲前期和收獲后期的環(huán)境、生物逆境和非生物逆境等。熒光技術(shù)在研究植物當中有極其重要的優(yōu)勢，那就是它在可識別的癥狀出現(xiàn)之前檢測到脅迫。這在篩選抵抗不同逆境的基因時極其關(guān)鍵，提前檢測到脅迫能夠節(jié)約大量的工作時間。熒光技術(shù)還能快速、無損傷同時大量地檢測小植物。熒光技術(shù)不僅可以用在園藝的研究上，還可以應(yīng)用到作物的生產(chǎn)上來提高產(chǎn)量和質(zhì)量。最佳的作物培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)該基于作物的生理狀態(tài)。把這個理念付諸事實第一步需要技術(shù)上提供可靠的植物健康信息。在這方面，熒光技術(shù)可以應(yīng)用在溫室栽培等多方面產(chǎn)業(yè)。熒光技術(shù)可以像傳感器一樣，在作物早期進行分辨，識別出那些新陳代謝受損的作物，來避免由脅迫和病害等產(chǎn)生的損失。早期矯正脅迫可以預(yù)防作物的減產(chǎn)，還能有效地避免主觀的評判并能準確、客觀地監(jiān)控植物健康生長。但是，對熒光技術(shù)的應(yīng)用仍然處在一個進步期，目前商業(yè)化的熒光技術(shù)傳感器尚未應(yīng)用。未來的研究有很多可選方向，比如確定環(huán)境最佳的范圍，這樣可以影響作物產(chǎn)量（溫度、照度、水等）。通過控制溫室作物每一個環(huán)境因素在最佳范圍，有助于優(yōu)化肥料的使用和環(huán)境的管理。熒光技術(shù)主要通過對植物在逆境中的測量，來區(qū)別每個環(huán)境因素的最佳和非最佳水平。盡管熒光技術(shù)在園藝學上是一種非常實用并有前途的一項技術(shù)，但是也有它自身的不足。比如，熒光信號的成像會由于表面組織不平整而受到干擾，因為吸收光的多少不一樣。強烈的反光面，如石蠟、毛發(fā)或者表面有灰塵都會干擾熒光信號。熒光技術(shù)在研究中非常重要，但更重要的是，未來熒光技術(shù)將作為溫室內(nèi)環(huán)境脅迫的指針和收獲后的分級工具。未來的商業(yè)設(shè)備將依靠這項技術(shù)和PSⅡ吸收光并發(fā)出熒光準確測定產(chǎn)量。需要注意的是，熒光技術(shù)要求園藝產(chǎn)品最少有一點葉綠素才能使用。此外，考慮到不同的設(shè)備和測量標準，不同試驗之間的參數(shù)對比起來是相當困難的。所以有必要定義一個通用的標準，使得試驗可以重復(fù)。另外在生產(chǎn)中，作物通常都會同時面臨多種逆境。雖然熒光技術(shù)已經(jīng)證明是非常好的檢測工具，但是想弄清楚是哪種脅迫影響了作物還是非常困難的。這也許需要進一步的研究參數(shù)。

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（責任編輯 潘 峰）