轉(zhuǎn)玉米C₄型PEPC基因油菜葉片特異性表達(dá)的可行性探討

摘要：C4型PEPC基因?qū)隒3植物可提高C3植物的光合能力，抑制油菜C3型PEPC基因的表達(dá)能提高油菜含油量，因此要進(jìn)一步提高油菜的光合生產(chǎn)力和促進(jìn)油脂積累，有必要在油菜葉片中特異性地表達(dá)玉米的C4型PEPC基因。通過克隆玉米、水稻和油菜的rbcS葉片特異性啟動子，構(gòu)建rbcS調(diào)控的玉米C4型PEPC基因葉片特異性表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化油菜獲得葉片特異性高效表達(dá)的轉(zhuǎn)PEPC基因植株，與原種和轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC基因油菜相比較，研究各株系PEPC酶活性和光合生理表現(xiàn)；根、莖、葉與種子器官玉米C4型PEPC基因的表達(dá)差異；分析各株系油菜油脂和蛋白質(zhì)含量、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。通過在油菜葉片中特異性地表達(dá)玉米的C4型PEPC基因，提高油菜單葉的光合速率，促進(jìn)油菜油脂積累，為油菜的高產(chǎn)育種提供新途徑。

關(guān)鍵詞：油菜；PEPC基因；rbcS啟動子；光合速率

中圖分類號：S634.3；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5396-03

1 玉米C4型PEPC基因?qū)胗筒说囊饬x

油菜（Rape or Rapeseed or Canola）是以菜子榨油為種植目的的一年生或越年生草本植物，已成為四大油料作物（大豆、油菜、向日葵和花生）之一。與世界上油菜單產(chǎn)水平高的國家相比，中國的差距還很大，但這也說明中國油菜生產(chǎn)在栽培和育種技術(shù)方面還大有潛力可挖。在適宜的環(huán)境條件下，田間的光能利用率可達(dá)5%，而現(xiàn)有光能利用率只有1.11%左右[1]，可見改善光合效率的潛力還很大。但分析現(xiàn)有品種的增產(chǎn)潛力，在葉面積指數(shù)達(dá)到9以上時，擴(kuò)大葉面積指數(shù)，會引起群體內(nèi)光能分布的惡化，因此在適宜的光合面積上提高單葉的光合速率，是進(jìn)一步增加油菜生產(chǎn)能力的一條有效途徑。

提高植物的光合效率可能有多種途徑，其中將C4光合基因PEPC導(dǎo)入C3植物以提高C3植物的C4光合特性，取得了顯著的成績，Ku等[2]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)系統(tǒng)， 首次成功地將玉米C4光合途徑的關(guān)鍵酶PEPC的基因?qū)隒3植物水稻中，獲得了高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。已有的研究表明轉(zhuǎn)PEPC基因水稻在高光照下表現(xiàn)出高光合能力[2-7]和耐光氧化的特性[8]。陳緒清等[9]利用基因槍轉(zhuǎn)化法，獲得了轉(zhuǎn)玉米PEPC基因的小麥植株。大量試驗(yàn)表明，通過分子生物學(xué)方法可在C3植物中高水平表達(dá)C4高光效基因，C4型PEPC基因在C3植物中參與代謝，對C3植物的生理產(chǎn)生影響?？梢娡ㄟ^導(dǎo)入C4光合基因以改良C3植物光合性能，可能是在現(xiàn)有株型和雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高C3植物的光能利用率，實(shí)現(xiàn)作物高光效育種的有效途徑。本研究已成功地將來自玉米的PEPC基因?qū)胗脱?號和Westar，并獲得高表達(dá)植株，通過T1代植株相關(guān)指標(biāo)測定，凈光合速率可提高15%左右。

2 玉米C4型PEPC基因在油菜葉片上的特異性表達(dá)——促進(jìn)光合作用與油脂合成

油菜種子蛋白質(zhì)含量與油脂含量呈高度的負(fù)相關(guān)[10]，丙酮酸羧化酶是將丙酮酸進(jìn)入蛋白質(zhì)合成循環(huán)的關(guān)鍵酶，陳錦清等[11]利用反義技術(shù)抑制油菜PEPC基因表達(dá)，結(jié)果使油菜含油量顯著提高，張銀波等[12]利用RNAi技術(shù)抑制油菜PEPase基因的表達(dá)，使代謝流偏向油脂合成，從而提高油菜子粒中的油脂含量，汪承剛等[13]、張勇等[14]抑制種子PEPC表達(dá)，以期提高油菜種子的含油量。可見玉米C4型PEPC基因的導(dǎo)入可使油菜的光合生產(chǎn)力增加，但組成型啟動子使外源PEPC基因在轉(zhuǎn)基因植株中不同組織都表達(dá)，不利于油菜在種子中油脂的積累。植物葉片是主要的光合器官，在能量的固定和利用中起著十分重要的作用，而PEPC是C4光合途徑中的關(guān)鍵酶之一，在葉片中最初固定CO2的酶，因此在葉片中特異性地表達(dá)玉米C4型PEPC基因，既有利于提高油菜葉片的光合能力，又有利于在油菜種子中合成油脂。

3 構(gòu)建玉米C4型PEPC基因葉片特異性的表達(dá)載體

許多葉片特異表達(dá)的基因產(chǎn)物都參與光合過程，葉片特異表達(dá)啟動子對相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。關(guān)于葉片特異表達(dá)啟動子rbcS（The small subunits of ribulose 1， 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）、Cab（Chlorophyll a/b binding protein）、PNZIP（Pharbitis nilleu zipper）等的研究較多，也證實(shí)了可驅(qū)動外源基因在葉片特異表達(dá)的功能。①rbcS基因啟動子能介導(dǎo)目的基因在植物綠色組織特異性表達(dá)，在基因工程中的應(yīng)用前景廣闊[15]，劉巧泉等[16]證實(shí)水稻rbcS啟動子可驅(qū)動GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片和葉鞘內(nèi)的葉肉細(xì)胞中特異性高效表達(dá)；王友如[17]從浮萍基因組中克隆了一個新的rbcS基因啟動子，并對該啟動子做了序列分析。劉德兵等[18]以巴西香蕉為材料，克隆分析了rbcS基因啟動子。②PNZIP含有一個能與DNA結(jié)合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個核定位信號肽，Zheng等[19]從典型短日照植物裂葉牽牛中克隆了編碼轉(zhuǎn)錄因子PNZIP的基因，而后楊予濤等[20]從短日照植物裂葉牽牛中克隆了PNZIP基因啟動子，證明了在葉片組織中長度為1 415 bp的PNZIP啟動子活性比355 bp的啟動子高9倍。肖守華等[21]證明PNZIP啟動子能驅(qū)動小麥抗真菌γ-2硫堇蛋白（γ2Thionin）基因在甜瓜葉片組織中表達(dá)。③植物捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體（Chlorophyll a/b binding protein，Cab）基因是一類典型的光誘導(dǎo)型基因，植物中的Cab啟動子具有光誘導(dǎo)和組織特異表達(dá)的特性[22]，Simpson等[23]證明梨Cab基因上游400 bp的啟動子序列能驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的特異表達(dá)，王旭靜等[24]分離了金華中棉（Gossypiun arboreum var. Jinhua）光誘導(dǎo)基因Cab 5′上游的調(diào)控序列1 009 bp，證明獲得的這一DNA片段具有驅(qū)動光誘導(dǎo)表達(dá)的功能，比CaMV35S啟動子高0.6倍?？梢娡ㄟ^克隆多種類型的葉片特異性啟動子，構(gòu)建玉米C4型PEPC基因葉片特異性表達(dá)載體，在油菜葉片中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，在種子器官中弱表達(dá)或不表達(dá)，增大“源”的供應(yīng)，同化更多能量，有利于油菜在種子中合成更多的油脂，培育含油量高的新品系。

4 結(jié)語

轉(zhuǎn)PEPC基因水稻植株不僅使PEPC活性提高20倍，而且其光合速率和羧化效率也分別比原種提高55%和50%，產(chǎn)量提高14%～22%[25]，并表現(xiàn)出一定的抗氧化等生理特性[26]，這說明PEPC基因?qū)隒3植物可以提高C3植物的光合生產(chǎn)力，增強(qiáng)C3植物的抗逆性。凌啟鴻等[27]指出，開花期是油菜生長量旺盛的階段，花后干物質(zhì)凈增量與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，花后油菜光合能力對干物質(zhì)積累和產(chǎn)量影響明顯，因此C4型PEPC基因?qū)胗筒撕竽芴岣哂筒说墓夂仙a(chǎn)力，增強(qiáng)抗逆性。本研究已獲得轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因的油菜植株，其PEPC酶的活性較原種有顯著的提升（約17倍左右），凈光合速率提高了15%左右，表明玉米C4-PEPC基因在油菜中成功表達(dá)。

綜上所述，將玉米C4型PEPC導(dǎo)入油菜中，并在葉片中實(shí)現(xiàn)特異性表達(dá)，獲得高表達(dá)的植株，提高油菜單葉的光合速率，促進(jìn)干物質(zhì)的積累，增加油菜種子油脂含量，可為培育含油量高、抗逆性強(qiáng)的油菜新品系提供新的技術(shù)途徑。

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（責(zé)任編輯 潘 峰）