稻瘟菌激活蛋白基因的克隆及表達(dá)

摘要：以提取的稻瘟菌（Magnaporthe grisea）基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出激活蛋白目的基因DW，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-KG-DW并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，pGEX-KG-DW載體添加IPTG后能在BL21中表達(dá)，在68 ku處存在一條特異性帶。

關(guān)鍵詞：稻瘟菌（Magnaporthe grisea）；激活蛋白；克隆；表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4807-02

激活蛋白是從交鏈孢菌（Alternaria spp.）、紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、黃曲霉菌（Aspergillus spp.）、葡萄孢菌（Botrytis spp.）、青霉菌（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）等多種真菌中篩選、分離、純化出的一種新型蛋白[1]。其蛋白分子質(zhì)量為42 ku，等電點(diǎn)為4.8[2]，能誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，促進(jìn)植物生長，改善作物品質(zhì)，可作為一種新型的廣譜、高效、多功能的生物農(nóng)藥[3]。稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌病害[4]。從稻瘟菌中提取出的激活蛋白稱稻瘟菌激活蛋白[5]，該蛋白能明顯促進(jìn)植物的發(fā)芽、生長、抗逆[6]。研究表明，經(jīng)過激活蛋白處理后，水稻幼苗可增加對(duì)稻瘟菌的抗性[7]。植物激活蛋白也能干擾煙草花葉病毒外殼蛋白的體外聚合過程[8]。大田試驗(yàn)證明激活蛋白處理后植物抗病率高達(dá)70%以上[9]。激活蛋白具有無公害、無殘留、無污染等特征，既可作為植物生長調(diào)節(jié)劑，又可作為生物農(nóng)藥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[10]。本研究通過構(gòu)建稻瘟菌激活蛋白表達(dá)載體，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)該基因的高效表達(dá)，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)該蛋白提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟菌北1-24，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供；化學(xué)誘導(dǎo)型表達(dá)載體pGEX-KG，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T載體，購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.4 融合表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中表達(dá)

1）以DW1和DW2為引物，pMD-18-DW為模板，PCR擴(kuò)增稻瘟菌激活蛋白基因片段并連接至pGEX-KG載體上。將鑒定正確的pGEX-KG-DW質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。

2）將大腸桿菌BL21重組菌pGEX-KG-DW接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。然后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（約2～3 h），加入0.5 mmol/L IPTG，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別在2、4、6、8、10 h進(jìn)行取樣，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟菌基因組DNA的提取及序列分析

提取了日本稻瘟菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增激活蛋白基因，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。PCR擴(kuò)增得到1條大小為1.6 kb的片段，并送至上海申能博采生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，同源性為100%。

2.2 融合表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)

經(jīng)序列測(cè)定，克隆載體pMD-18-DW插入片段中引入的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、起始密碼子、終止密碼子和讀碼框正確。BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pMD-18-DW，回收目的片段與pGEX-KG載體連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-KG-DW，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。

結(jié)果（圖2）表明，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)。泳道1為連有目的蛋白的載體不加誘導(dǎo)物在BL21中的表達(dá)，結(jié)果顯示沒有特異性帶；泳道2為連有目的蛋白的載體添加IPTG后能在BL21中的表達(dá)，在68 ku處存在一條特異性帶。以上誘導(dǎo)時(shí)間均為5 h。

3 小結(jié)與討論

本研究利用PCR擴(kuò)增出1.6 kb的基因片段，然而從稻瘟菌基因組全序列分析推斷出的激活蛋白基因大小只有1.0 kb，基因組DNA由于含有內(nèi)含子，擴(kuò)增得到1.6 kb的片段是正常現(xiàn)象。稻瘟菌激活蛋白基因在融合表達(dá)載體中可以正常表達(dá)，但表達(dá)量較低，最佳的誘導(dǎo)條件有待于進(jìn)一步優(yōu)化選擇。本試驗(yàn)同時(shí)也研究了激活蛋白非融合表達(dá)載體pBV221的構(gòu)建及表達(dá)，結(jié)果重組非融合蛋白無法表達(dá)，具體原因不是很清楚，推測(cè)可能是由于此蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性，這方面內(nèi)容也有待于進(jìn)一步研究。

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程的應(yīng)用，給蛋白類農(nóng)藥的研究注入了新的活力，現(xiàn)已成為生物農(nóng)藥改良的有效途徑。利用分子生物學(xué)技術(shù)，從分子水平研究具有藥性功能的微生物基因及抗病蟲蛋白與宿主受體的相互作用及其機(jī)理，通過研究其編碼基因的克隆和表達(dá)，為蛋白類農(nóng)藥生物合成和提高蛋白類農(nóng)藥的效用提供分子生物學(xué)的理論依據(jù)。

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