釀酒酵母ARS305側翼序列對其自主復制活性的影響

摘要：利用PCR技術擴增了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ號染色體上以ARS（Autonomously replicating sequence，ARS）305為核心的不同長度側翼序列，并將其構建到酵母整合型載體pRS405中獲得了重組質粒PA500、PA1000、PA2000，然后通過電轉化法轉入釀酒酵母細胞中，測定了不同ARS305片段對酵母轉化效率及質粒在酵母中穩(wěn)定性。結果表明，并非側翼序列越長ARS活性越高，重組質粒PA1000具有比PA2000更高轉化頻率和轉化穩(wěn)定性，推測ARS兩側序列存在一些順式和反式的調控機制影響ARS自主復制功能。

關鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ARS305；重組質粒；復制起始活性

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4804-03

真核生物染色體中存在多個復制起始位點，能夠使真核生物巨大的基因組在較短時間內完成復制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的復制起始位點稱為自主復制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在釀酒酵母的TRPI基因緊密連鎖DNA序列中發(fā)現(xiàn)，含有ARS的質粒轉化酵母后能獨立存在于宿主染色體外且能自主復制[1]。此后，Irene等[2]從釀酒酵母Ⅲ號染色體中共發(fā)現(xiàn)有19個ARS，約為150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面卻表現(xiàn)出明顯的差異，部分活性高的ARS卻沒有ACS保守序列[3]。說明DNA復制起始功能不僅由ACS保守序列決定，還需核心序列3′和5′側翼序列的參與。

在酵母遺傳工程中，不考慮載體-宿主系統(tǒng)的類型、外源基因產物的性質和工程菌的培養(yǎng)條件等因素，重組質粒的穩(wěn)定性可以從功能上鑒定復制起始位點的活性。通過DNA重組技術將可能含有ARS的DNA片段構建到缺失復制起始位點的質粒后轉入細胞，如果它有較高的細胞轉化率并且表現(xiàn)為遺傳不穩(wěn)定性，就表明該片段在宿主菌中可能有復制起始位點活性[4]。本研究擴增了以ARS305為核心的不同長度側翼序列，并將其構建到酵母整合型載體pRS405中，通過電轉化法轉入釀酒酵母細胞中，測定了不同ARS片段對酵母轉化效率及質粒在酵母中穩(wěn)定性，為后續(xù)以酵母作為模式生物研究真核基因的復制與轉錄機制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 Esherichia coli DH5α為內蒙古科技大學生物工程與技術研究所基因工程實驗室保藏。釀酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型載體pRS405由美國新澤西州醫(yī)學院微生物學與分子遺傳學部Newlon教授饋贈。

1.1.2 試劑 DNA Marker，限制性內切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶及PCR產物純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；Agarose購自Invitrogen公司；PCR引物合成及DNA測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成；其他試劑藥品為進口分析純和生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母浸提物5 g/L，固體培養(yǎng)基瓊脂含量15 g/L）；釀酒酵母YPH499的培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基（胰蛋白胨20 g/L，酵母浸提物10 g/L，高壓滅菌20 min 后，加入100 mL滅菌的20 g/L葡萄糖溶液，固體培養(yǎng)基瓊脂含量15 g/L）。SD 篩選培養(yǎng)基（1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂）；氨基酸（20 mg/L Trp，20 mg/L His，20 mg/L Lys）。

1.2 方法

1.2.1 酵母基因組的提取 珠磨法提?。菏占^夜培養(yǎng)16～18 h的釀酒酵母YPH499菌液，用TE洗滌2次溶于200 μL TE中；加入50 mg玻璃珠（直徑0.3～0.5 mm）和100 μL酚∶氯仿（25∶24，V/V），漩渦振蕩2～3 min；12 000 r/min離心2 min，取上清，加入等體積酚∶氯仿（25∶24，V/V），抽提后12 000 r/min離心5 min；取上清，加入0.5 μL RNaseA，37 ℃溫浴30 min；加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心5 min，沉淀物用70%乙醇洗2次，自然干燥后溶于20 μL TE，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ARS305側翼序列的擴增 根據(jù)GenBank中釀酒酵母Ⅲ號染色體上的ARS305序列，利用Primer premier 5.0軟件設計了3對特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 擴增反應體系總體積為 25 μL：模板DNA 2.0 μL、10×DNA Polymerse Buffer 2.5 μL、EX Taq DNA Polymerse（5 U/μL）0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 μL、引物F1和R2（10 mmol/L） 1.0 μL、ddH2O 16.0 μL。PCR反應后回收目的條帶，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酵母自主復制質粒的構建 采用限制性內切酶XhoⅠ（PstⅠ）和BamHⅠ雙酶切PCR擴增純化產物和整合型載體pRS405，分別回收目的片段和載體片段， 16 ℃條件下T4 DNA連接酶連接24 h，連接產物轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐抗性（50 μg/mL）的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質粒雙酶切鑒定陽性克隆，同法構建另外兩個重組質粒。

1.2.4 重組質粒的電轉化 將純化的質粒加入到 100 μL釀酒酵母YPH499感受態(tài)細胞中，輕柔混勻后移入預冷的2 mm電擊杯中。按照文獻[5]設置參數(shù)，電擊后迅速加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇緩沖液。28 ℃靜置復蘇 1～2 h后加入1 mL液體YPD培養(yǎng)基，于30 ℃、100 r/min下培養(yǎng)1 h。濃縮培養(yǎng)液，將其均勻涂布于含100 μg/mL亮氨酸的YPD平板上，30 ℃避光下培養(yǎng)，得到轉化子。再從酵母轉化子中提取質粒DNA，轉化入E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，抽提質粒 DNA 并進行雙酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 ARS305側翼序列的擴增

PCR產物經 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，所擴增片段分別為1 200、1 700、2 300 bp，與預期大小相符（圖1）。

2.2 酵母自主復制質粒的構建及檢測

酵母整合型質粒pRS405可以在大腸桿菌中復制，氨芐青霉素抗性基因可作為篩選標記。但它不能在酵母中復制，只有通過重組到酵母染色體上才能隨染色體的復制而復制。pRS405帶有LEU基因可作為在酵母LEU基因缺失株中的篩選標記。將擴增的目的片段插入到酶切的pRS405載體中以檢測ARS305側翼序列自主復制活性。挑取單菌落，接種于氨芐抗性液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，堿裂解法提取質粒。經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳結果與預期大小相符（圖2），表明成功構建了自我復制型載體PA500、PA1000、PA2000。

2.3 ARS功能質粒丟失率的測定

酵母轉化效率是鑒定自主復制活性強弱的直接指標。將質粒PA500、PA1000、PA2000定量轉化酵母。結果表明，盡管這些片段均有ARS活性，但酵母轉化效率存在一定差異，且質粒PA1000比PA2000有更高的轉化頻率。

由于含有 ARS 片段的質粒在酵母細胞內獨立復制，并非整合到酵母染色體上，所以在細胞分裂過程中，就存在質粒丟失問題。將含有質粒PA500、PA1000、PA2000的酵母于完全YPD培養(yǎng)基中經約8代培養(yǎng)（16 h），經計算質粒PA500每代的丟失率為16.2%，質粒PA1000 每代的丟失率為10.7%，質粒PA2000每代的丟失率為13.8%。這說明它們在酵母中都是不穩(wěn)定的（表2）。

3 小結與討論

盡管真核生物的復制在進化中有很強的保守性，但不同物種的DNA復制起始位點之間卻缺少明顯的一致序列或結構。釀酒酵母的復制起始位點由11 bp的ACS保守序列和幾個輔助序列（B區(qū)）組成。ACS是復制起始識別蛋白ORC結合位點。ACS的側翼序列不保守，但其對ARS的活性卻是非常重要的[7]。

雖然在酵母中大多數(shù)ARS都有ACS，但其中有些位點的使用頻率比其他位點的更高，且有一些潛在的復制起始位點在正常生長條件下從不使用，而一旦這些潛在的復制起始位點序列克隆到質粒上，都能有效地作為復制起始位點行使其功能。因此，在酵母細胞核中染色體的環(huán)境諸如核小體定位、染色質修飾、ARS序列特征等能決定哪些潛在的位點被用作起始點以及使用的頻率。Theis等[3]研究發(fā)現(xiàn)當敲除Ⅲ號染色體上其他高活性ARS，ARS308復制起始活性大大增強。Eaton等[8]等利用高通量列分析測定了酵母體內ARS兩側的核小體定位圖譜，發(fā)現(xiàn)酵母復制起始位點ARS兩側核小體分布具有一定的規(guī)律，復制起始識別蛋白ORC的結合也需要ARS兩側精確的核小體定位。

本研究擴增了釀酒酵母Ⅲ號染色體有活性的ARS305及以ARS305為核心不同長度的側翼序列，并將目的片段構建到酵母整合型載體pRS405中獲得重組質粒PA500、PA1000、PA2000。酵母電轉化試驗發(fā)現(xiàn)ARS活性不僅受ACS元件控制，其旁側序列對其活性也有重要影響，且并非側翼序列越長活性越高（PA1000具有比PA2000更高轉化頻率和轉化穩(wěn)定性），推測延長的1 000 bp序列為ARS305活性負調節(jié)元件，與相應的反式作用因子共同調控ARS305活性，因此ARS功能并不完全依賴于ACS和解鏈程度，可能涉及一些順式和反式的調控機制。

參考文獻：

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[8] EATON M L， GALANI K， KANG S， et al. Conserved nucleosome positioning defines replication origins[J]. Genes Development，2010，24（8）：748-753.