HPLC法測(cè)定6種蝗蟲(chóng)中黃酮類(lèi)化合物

摘要：以長(zhǎng)額負(fù)蝗、短額負(fù)蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢6種蝗蟲(chóng)為材料，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，探索了高效液相色譜法測(cè)定蝗蟲(chóng)中黃酮類(lèi)化合物含量的方法。色譜條件為色譜柱C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V），進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。檢測(cè)得到長(zhǎng)額負(fù)蝗、短額負(fù)蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢中的黃酮類(lèi)化合物含量分別為11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好，可用于測(cè)定蝗蟲(chóng)中黃酮的含量，結(jié)果表明蝗蟲(chóng)是黃酮類(lèi)化合物含量很高的資源生物，進(jìn)一步研發(fā)具有廣闊前景。

關(guān)鍵詞：蝗蟲(chóng)；黃酮類(lèi)化合物；提??；測(cè)定；高效液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4785-04

黃酮類(lèi)化合物（Flavonoids）是廣泛存在于植物體的一大類(lèi)化合物，目前已知種類(lèi)達(dá)8 000多種。研究證明黃酮類(lèi)化合物主要有以下生物學(xué)作用：保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、抗癌抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒、抗氧化、抗輻射等[1-4]，是目前保健品中添加量最多的功能性物質(zhì)之一?；认x(chóng)屬直翅目昆蟲(chóng)，世界上現(xiàn)已記載的蝗蟲(chóng)種類(lèi)多達(dá)10 000種，我國(guó)已知蝗蟲(chóng)超過(guò)1 000種[5-7]?；认x(chóng)不僅具有非常好的資源優(yōu)勢(shì)，還具有豐富的功能成分。見(jiàn)諸報(bào)道的研究包括功能性脂肪酸和磷脂的研究；抗凍蛋白、儲(chǔ)存蛋白、熱休克蛋白的研究[8-11]；但鮮見(jiàn)有從蝗蟲(chóng)中分離純化出黃酮類(lèi)物質(zhì)的報(bào)道[12-20]。

本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)額負(fù)蝗[Atractomorpha lata （Motschoulsky）]、短額負(fù)蝗（A. sinensis Bolivar）、斑角蔗蝗（Hieroglyphus annulicomis Shir）、山稻蝗（Oxya agavisa Tsai）、中華稻蝗[O. chinensis （Thunberg）]和中華蚱蜢[Acrida cinerea （Thunberg）]6種蝗蟲(chóng)中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了提取物高效液相色譜檢測(cè)方法，并測(cè)定其黃酮類(lèi)化合物的含量，為蝗蟲(chóng)黃酮類(lèi)化合物資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料分別采集于湖北省黃岡市英山縣和黃州區(qū)（表1）。

1.2 試劑

蘆?。ò⒗≡噭┕?，批號(hào)為1108860），甲醇（色譜純），磷酸；石油醚（沸程30～60 ℃）、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、正丁醇、三氯化鋁、濃氨水等均為分析純；超純水。

1.3 儀器

高效液相色譜儀（2695，美國(guó)Waters公司），配備二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱，Symmetry 300TM C18（5 μm， 4.6 mm×250 mm，美國(guó)Waters公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；快速粉碎機(jī)（GDYQ-704S，廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（AB204-E，上海精細(xì)天平有限公司）；脂肪測(cè)定儀（SZF-06A，上海精隆科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水真空泵（SHZ-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程 工藝流程參照文獻(xiàn)[12]，流程如下：山稻蝗經(jīng)鑒定后-40 ℃冷凍處死，保存，試驗(yàn)時(shí)稱(chēng)取冷凍山稻蝗，去消化道后放入烘箱中干燥至恒重，再將烘干的山稻蝗進(jìn)行粉碎過(guò)40目篩，密封包扎備用；以石油醚為脫脂劑，將粉末用于脂肪測(cè)定儀于70 ℃恒溫回流6 h以脫去脂肪，殘?jiān)鼡]去石油醚后干燥備用；準(zhǔn)確稱(chēng)量（1.0 g）脫脂山稻蝗粉末水浴回流提取黃酮，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.4.2 高效液相色譜測(cè)定 參照文獻(xiàn)[20]的方法，稍作調(diào)整。將提取的黃酮溶液用甲醇稀釋10倍，過(guò)0.22 μL微孔有機(jī)濾膜后備用。色譜條件為Symmety C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；色譜柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝗蟲(chóng)黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn) 分別探索不同有機(jī)溶劑、甲醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比對(duì)提取效率的單因素試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇、甲醇濃度80%、浸提時(shí)間2.5 h、浸提溫度75 ℃、料液比（1∶40，m/V）時(shí)對(duì)蝗蟲(chóng)黃酮的提取效果最好。

2.1.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化 為更加全面考察各影響因素，設(shè)計(jì)了4因素4水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

根據(jù)試驗(yàn)因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)得正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可以看出，各因素對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取效果的影響大小為浸提時(shí)間>甲醇濃度>浸提溫度>料液比。

2.2 6種蝗蟲(chóng)黃酮的最佳提取工藝分析

其他5種蝗蟲(chóng)的提取工藝試驗(yàn)探究及優(yōu)化與山稻蝗的基本相同，經(jīng)試驗(yàn)探究確定其最佳提取條件見(jiàn)表4。

2.3 6種蝗蟲(chóng)中的黃酮含量分析

通過(guò)試驗(yàn)確定高效液相色譜法測(cè)定黃酮條件及其相應(yīng)含量見(jiàn)表5。

從表5可以看出，不同種類(lèi)的蝗蟲(chóng)黃酮類(lèi)化合物含量差異較大，從蝗蟲(chóng)類(lèi)群來(lái)看，斑腿蝗科的山稻蝗的含量最高，為13.827 mg/g，斑角蔗蝗和中華稻蝗的含量較低，其中斑角蔗蝗的含量最低，為5.035 mg/g；錐頭蝗科負(fù)蝗屬的2種蝗蟲(chóng)黃酮含量都較高；劍角蝗科中華蚱蜢含量居中，為7.181 mg/g?；认x(chóng)黃酮類(lèi)化合物的含量沒(méi)有表現(xiàn)出分類(lèi)類(lèi)群的規(guī)律性，相關(guān)高效液相色譜圖見(jiàn)圖1-6。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取不同濃度的黃酮提取液0.5 mL，分別放入5支試管中，再分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。其余步驟按“1.4.2”進(jìn)行，測(cè)定其峰面積，計(jì)算其回收率為98.23%，檢測(cè)方法的回收率都滿足試驗(yàn)的要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取黃酮甲醇溶液1 mL，其余步驟按“1.4.2”進(jìn)行，測(cè)定其峰面積，重復(fù)5次。平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%，可滿足試驗(yàn)要求。

3 小結(jié)與討論

影響蝗蟲(chóng)中黃酮類(lèi)化合物提取效果的主次順序?yàn)椋航釙r(shí)間>甲醇濃度>浸提溫度>料液比。通過(guò)測(cè)定方法規(guī)范研究確定了HPLC法測(cè)定黃酮含量的條件為：色譜柱C18 （5 μm，250 mm × 4.6 mm）；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速為1.0 mL/min；試驗(yàn)測(cè)出的長(zhǎng)額負(fù)蝗、短額負(fù)蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢中的黃酮含量分別為11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。本測(cè)定方法較以往的方法更快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)。蝗蟲(chóng)含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，且種類(lèi)間的差異較大。山稻蝗的含量最高，為13.827 mg/g，斑角蔗蝗的含量最低，為5.035 mg/g。由此可見(jiàn)，蝗蟲(chóng)是一種很好的天然黃酮源。

目前有關(guān)黃酮類(lèi)物質(zhì)的主要研究對(duì)象為植物[15，16]，關(guān)于動(dòng)物中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究報(bào)道較少，所研究的蝗蟲(chóng)種類(lèi)也很少，且蝗蟲(chóng)中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量測(cè)定多使用傳統(tǒng)的比色法。應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)蝗蟲(chóng)中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。該研究為蝗蟲(chóng)的黃酮類(lèi)物質(zhì)的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定技術(shù)參數(shù)與試驗(yàn)依據(jù)。本研究中6種蝗蟲(chóng)的黃酮類(lèi)化合物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于霍山蹦蝗（0.41%）[12]和蜂蛹（0.45%）[17]的含量，甚至比常見(jiàn)的中草藥如葛根（1.7%）[18]、木犀草（1.9%）[19]、銀杏葉的黃酮含量[20，21]（2.9%）都高。

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