歐李種仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性

摘要：采用HPLC法測定歐李（Prunus humilis Bunge）種仁濃縮液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法測定苦杏仁苷的抗氧化性。結(jié)果表明，提取液中苦杏仁苷的濃度為7.94 mg/mL；苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著其濃度的降低而下降，當苦杏仁苷溶液濃度為7.50 mg/mL時清除率最高，為90.9%。歐李種仁濃縮液經(jīng)氯仿、乙酸乙酯和加熱處理均能提高水相中苦杏仁苷的純度。

關鍵詞：歐李（Prunus humilis Bunge）；種仁；苦杏仁苷；高效液相色譜；抗氧化性

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4764-04

歐李（Prunus humilis Bunge）為薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，是我國特有的果實和藥食兼用樹種。其莖葉、果實、根皮具有很高的經(jīng)濟和藥用價值。歐李種仁可以入藥，具有利尿、助消化等功效，能治療消化不良、水腫、腸胃停滯等疾病[1-3]。歐李種仁中含有大量的苦杏仁苷，主要用于治療慢性氣管炎、急慢性呼吸道感染和膿皰病[4]，與其他藥物合用還可治療皮膚癌[5]；苦杏仁苷還具有抗凝血和抗氧化性的作用[6]。

苦杏仁苷具有明確的生理、藥理活性。關于苦杏仁苷分析檢測的方法也比較完善，但國內(nèi)對歐李苦杏仁苷分離提取工藝的深入研究還較少，所以本試驗采用HPLC法測定歐李種仁濃縮液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法測定苦杏仁苷的抗氧化性，以期為歐李苦杏仁苷提取工藝的改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2012年6月在成都大學藥食同源植物資源開發(fā)重點實驗室進行。歐李采自成都大學歐李種植基地。

將風干的歐李果實去果肉得到歐李種子，反復淘洗將果肉和種子分開，把得到的歐李種子放入烘箱中50 ℃干燥24 h。干燥后人工去殼得到歐李種仁，將歐李種仁放入烘箱中50 ℃干燥48 h，備用。

1.2 儀器與試劑

DIONEX-HPCL高效液相色譜儀；UV-1800紫外分光光度計。

苦杏仁苷標準品（純度大于99.0%，中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、甲醇和石油醚（成都市科龍化工試劑廠）；DPPH（成都康普泰科技有限公司），以上試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作 準確稱取20 mg苦杏仁苷標準品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。采用UV-1800紫外分光光度計多波長掃描檢測苦杏仁苷標準品的最大吸收波長。

標準曲線的制作：精確稱取20 mg苦杏仁苷標準品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。準確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于EP管中，分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL甲醇，配制成終濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的系列標準品溶液。采用HPLC法測定不同濃度標準溶液，得到相應的峰面積。以系列標準溶液的濃度（C）為橫坐標，色譜峰面積（A）為縱坐標，制作苦杏仁苷標準曲線。

色譜條件：色譜柱 C18柱；流動相，甲醇-水=30∶70；柱溫28 ℃；檢測波長220 nm；流速1 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2 歐李種仁中苦杏仁苷的提取及含量測定 取100 g干燥種仁粉碎。將粉碎后的歐李種仁粉末置于1 000 mL的燒瓶中，加入230 mL無水乙醇，恒溫水?。?0～90 ℃）回流1 h，抽濾收集濾液，3次重復。向合并濾液中加入少量蒸餾水，利用石油醚萃取去除濾液中的油脂，待分層后取下層液體。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將下層液體加熱濃縮，得到苦杏仁苷濃縮液，利用蒸餾水定容至100 mL。分別取1 mL上述溶液于2支EP管中，離心處理，取50 μL上清液稀釋30倍，0.22 μm微孔濾膜過濾，利用HPLC法檢測苦杏仁苷的含量。

1.3.3 苦杏仁苷抗氧化性測定 0.6 mmol/L DPPH溶液配制：精確稱取0.039 g DPPH，用95%乙醇定容至50 mL，稀釋10倍后得到0.6 mmol/L DPPH溶液備用。

反應體系：1 mL待測液加入2 mL 0.6 mmol/L DPPH和2 mL 95%乙醇，以不加樣品為對照，混勻后于暗處反應30 min；另取5 mL 95%乙醇作調(diào)零對照；在517 nm處測定吸光值（A值）。配制7.5 mg/mL的苦杏仁苷提取液，進行二倍稀釋得到8個濃度梯度，分別為7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3 mg/mL。將稀釋后溶液作為抗氧化性測定的待測液，測定其吸光值（A）[7]。

1.3.4 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷 取苦杏仁苷濃縮液5 mL分別置于2個分液漏斗中，分別加入等體積的氯仿和乙酸乙酯，充分振蕩混勻，靜置，待分層后，分別取有機相和水相利用“1.3.2”的方法測定苦杏仁苷的濃度。

1.3.5 加熱對苦杏仁苷純度的影響 將苦杏仁苷濃縮液5 mL置于燒杯中，沸水浴中加熱處理10 min，之后取樣經(jīng)離心后按照“1.3.2”的方法測定苦杏仁苷的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁苷最大吸收波長的確定

如圖1所示，采用UV-1800紫外分光光度計于200～400 nm波長下進行多波長掃描，得到苦杏仁苷標準品的最大吸收波長是220 nm，故在后續(xù)色譜檢測苦杏仁苷含量時選擇220 nm的檢測波長。

2.2 苦杏仁苷標準曲線

根據(jù)標準溶液測得的不同濃度標準品溶液色譜圖（圖2）進行分析，得到各個濃度標準溶液的數(shù)據(jù)，如表1所示。根據(jù)表1中數(shù)據(jù)制作標準曲線，如圖3所示。以苦杏仁苷濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標繪制得到苦杏仁苷標準曲線。該回歸曲線線性良好，相關系數(shù)R2=0.997 1，可以用于計算苦杏仁苷的濃度。

2.3 歐李種仁中苦杏仁苷的含量

采用HPLC法進行檢測，得到歐李種仁中苦杏仁苷的色譜圖（圖4），其峰面積為731.757 mAU·min。根據(jù)標準曲線計算出溶液中苦杏仁苷濃度為7.94 mg/mL，即每100 g歐李種仁中苦杏仁苷含量為794 mg。

2.4 苦杏仁苷抗氧化性的測定

研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化性，能夠還原DPPH[8]。由表2可知，苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著苦杏仁苷溶液濃度的降低而下降。苦杏仁苷溶液濃度為7.50 mg/mL時，對DPPH的清除率最高，為90.9%；當苦杏仁苷溶液濃度為0.234 4 mg/mL時，清除率下降為5.4%。

2.5 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷

分別采用氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷，結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯均不能將混合液中的苦杏仁苷完全萃取出來；經(jīng)檢測，苦杏仁苷在氯仿相中的含量僅為0.17 mg/mL，在乙酸乙酯相中僅為0.21 mg/mL，低于萃取之后保留在水相中的苦杏仁苷的含量，表明氯仿和乙酸乙酯不能作為苦杏仁苷的萃取劑使用。但是苦杏仁苷混合液經(jīng)過兩種有機溶劑萃取后，保留在水相中的苦杏仁苷的含量較萃取之前有了較為明顯的提高。這可能是混合液中的部分雜質(zhì)被氯仿和乙酸乙酯分別萃取出去，從而提高了水相中苦杏仁苷的相對含量。

2.6 加熱對苦杏仁苷純度的影響

利用沸水浴加熱可以使醇溶性蛋白發(fā)生變性，從而提高苦杏仁苷的純度。水相提取液經(jīng)沸水浴加熱后，經(jīng)HPLC法測定苦杏仁苷含量色譜圖如圖5所示。溶液中苦杏仁苷濃度為12.1 mg/mL，相比較加熱前有了大幅度提高。說明通過加熱處理可以除去苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)，從而提高提取液中苦杏仁苷的純度。

DPPH法檢測加熱處理后苦杏仁苷的抗氧化活性結(jié)果表明，苦杏仁苷的抗氧化性大幅度地降低（表3）；與檢測不加熱處理苦杏仁苷的抗氧化性比較發(fā)現(xiàn)，在濃度為7.5 mg/mL時，加熱后其自由基清除率僅為69.8%；而濃度為1.875 mg/mL時的清除率為0。說明經(jīng)過加熱處理后，苦杏仁苷提取液的抗氧化活性有了明顯的下降。

3 小結(jié)與討論

已有研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化作用[6]。本試驗研究結(jié)果表明，苦杏仁苷清除DPPH的能力隨著苦杏仁苷溶液濃度的降低而下降?？嘈尤受杖芤簼舛葹?.50 mg/mL時對DPPH的清除率最高，為90.9%。

本試驗中提取苦杏仁苷的方法是采用無水乙醇在80～90 ℃下回流，因為試驗所用材料為植物種子，所以在提取苦杏仁苷的過程中，一些醇溶性蛋白和黃酮類化合物也會被提取出來[9-11]。采用氯仿和乙酸乙酯兩種溶劑對苦杏仁苷的萃取結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯不能作為苦杏仁苷的萃取劑使用。但是經(jīng)過兩種溶劑萃取后，苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)可以被兩種溶劑除去，從而提高了水相中苦杏仁苷的相對含量。

苦杏仁苷混合液經(jīng)過加熱處理后，苦杏仁苷的相對含量大幅增加，說明加熱處理可以去除苦杏仁苷溶液中的部分雜質(zhì)，從而提高苦杏仁苷的純度；然而苦杏仁苷的抗氧化活性卻大幅下降。經(jīng)檢測，加熱后苦杏仁苷溶液濃度為7.5 mg/mL時，自由基清除率僅為69.8%，這可能與加熱去除了部分黃酮或其他抗氧化成分有關[12，13]。

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