家蠅腸道益生菌胞外多糖抗氧化活性研究

摘要：從家蠅（Musca domestica）體內(nèi)篩選出兩株高產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌，分別命名為芽孢桿菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢桿菌xzf2（Bacillus sp.）。經(jīng)多糖分離純化，芽孢桿菌xzf1產(chǎn)胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）BEPS11、BEPS12，芽孢桿菌xzf2產(chǎn)胞外多糖BEPS21、BEPS22、BEPS23。分別檢測其清除1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基、羥自由基、超氧自由基的能力。結(jié)果表明，胞外多糖具有很強(qiáng)的清除活性氧自由基的能力，在較低濃度下很多多糖的清除能力都高于維生素C，是一種良好的天然抗氧化劑。該研究可為益生菌胞外多糖應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供一定的理論和方法依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腸道益生菌；胞外多糖；活性氧自由基；抗氧化活性；家蠅（Musca domestica）

中圖分類號：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4740-04

多糖在自然界高等植物、藻類、細(xì)菌及動物體內(nèi)均存在，分布極廣。近年來，微生物來源的多糖越來越引起人們的廣泛注意[1]。多糖是由多個單糖或單糖衍生物聚合而形成的大分子生物有機(jī)物質(zhì)[2]，是具有生物活性的復(fù)雜極性大分子，分子質(zhì)量比較大，與核酸、蛋白質(zhì)、脂類并稱為構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)，與維持生命所需的多種生理功能密切相關(guān)[3]。微生物胞外多糖是細(xì)菌、藍(lán)藻和真菌等微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的對其自身有保護(hù)作用的生物高聚物[4-6]，細(xì)菌胞外多糖在食品領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、石油工業(yè)等領(lǐng)域已具有廣泛的應(yīng)用，尤其是細(xì)菌胞外多糖因具有抗感染、抗病毒、抗輻射、抗血栓和免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤細(xì)胞活性等作用而引起重視[7，8]。

家蠅（Musca domestica）屬昆蟲綱雙翅目環(huán)裂亞目蠅科，是中國大部分地區(qū)最常見、數(shù)量最多的一種蠅類。由于其生活環(huán)境復(fù)雜、食物來源惡劣，家蠅的生存能力除與自身體內(nèi)存在大量抗菌活性物質(zhì)有關(guān)外，與腸道內(nèi)益生菌也有很大的關(guān)系。本研究旨在從家蠅腸道中篩選出產(chǎn)活性物質(zhì)的益生菌，為活性多糖的篩選另辟一條思路，以獲得更多有用的活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）購于Sigma公司，DEAE-Cellulose 52離子交換柱和Sephadex G-1000等試劑均為國產(chǎn)分析純級。

儀器：UV2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），SY-305B發(fā)酵罐（上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），MA99-2A自動核酸蛋白分離層析儀（上海滬西分析儀器有限公司），Scientz-10N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基[9]。

1.3 家蠅腸道產(chǎn)多糖菌的篩選

2011年10月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)捕獲活力很強(qiáng)的家蠅1只，立即將其浸入75%乙醇中進(jìn)行體表消毒滅菌1 min，在無菌環(huán)境下利用滅菌研缽和石英砂磨碎，加入1 mL無菌生理鹽水溶解，隨后將其稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列梯度，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，每梯度重復(fù)10次，在37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，選取黏稠、不易挑取的單克隆菌落劃線接種于試管斜面上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌種鑒定

從菌落形態(tài)和菌體顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察鑒定菌屬[10]。

1.5 菌種培養(yǎng)

1.6 多糖提取

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心，合并上清液，于50 ℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL， 加入4倍于濃縮液的無水乙醇進(jìn)行充分?jǐn)嚢瑁湃氡渲械蜏仂o置24 h，將沉降物采用差速離心法逐級沉淀獲得兩種粗多糖沉淀，將分離后的多糖在真空冷凍機(jī)中干燥至粉末狀。

1.7 多糖純化

將上述得到的粗多糖使用DEAE-Cellulose 52離子交換柱分離純化，利用苯酚硫酸法檢測多糖含量，并將其中含量較高的成分收集起來，利用Sephadex G-1000進(jìn)行分離純化，苯酚硫酸法和核酸蛋白儀跟蹤檢測獲得組分，冷凍干燥備用[12]。

1.8 多糖抗氧化活性的研究

1.8.2 超氧自由基的清除[14-19] 應(yīng)用鄰苯三酚自氧化體外模擬化學(xué)反應(yīng)，將1 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚加入到含不同濃度多糖溶液的pH 8.2 Tris-HCl緩沖液中，在兩液混合后10 min內(nèi)每隔30 s測其在325 nm處的吸光值。以不加多糖的反應(yīng)液為對照計(jì)算多糖對O2-的清除率。維生素C也以同樣方法測定其清除率。清除率的計(jì)算公式如下：

清除率=[（k0-k1）/k0]×100%，式中，k0為鄰苯三酚自氧化速率，即自氧化曲線的斜率；k1為加入不同濃度多糖后氧化曲線的斜率。

1.8.3 羥自由基的清除[16-19] 采用H2O2/Fe2+體系，通過Fenton反應(yīng)生成羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510 nm處有最大吸光值。取不同濃度的多糖溶液和維生素C各1 mL于試管中，分別加入9 mmol/L的FeSO4 1 mL、9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入9.8 mmol/L的H2O2 1 mL啟動整個反應(yīng)。反應(yīng)體系在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)50 min，然后在510 nm處測定其吸光值A(chǔ)i，用水代替H2O2用上述同樣方法測定吸光值A(chǔ)j，用水代替多糖溶液（空白對照）用上述同樣方法測定吸光值A(chǔ)c。維生素C也以相同方法測定其清除率。清除率的計(jì)算公式如下：清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種及形態(tài)學(xué)特征

通過菌落形態(tài)及顯微觀察，初步判定所篩選出的兩株細(xì)菌屬芽孢桿菌屬（Bacillus），分別命名為芽孢桿菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢桿菌xzf2 （Bacillus sp.），其菌落形態(tài)及顯微染色形態(tài)見圖1、圖2、圖3、圖4。兩株菌落皆不透明，乳白色，菌落突起皺褶，邊緣不整齊；不易挑起，黏稠拉絲狀，有霉菌抑菌圈。顯微觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，芽孢近圓形，有些芽孢正萌發(fā)。經(jīng)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus），而且應(yīng)為產(chǎn)胞外多糖芽孢桿菌，經(jīng)莢膜染色證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.2 多糖的分離純化結(jié)果

兩株細(xì)菌擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)后，培養(yǎng)液經(jīng)濃縮后加4倍體積無水乙醇，首先采用差速離心法初步分離多糖，經(jīng)冷凍干燥得粗多糖。芽孢桿菌xzf1發(fā)酵液提取獲得2種粗多糖，即BEPS11、BEPS12，其中BEPS11先被離心下來，為白色離散粗顆粒狀；BEPS12后被離心下來，為紅色黏稠狀。芽孢桿菌xzf2得3種粗多糖，即BEPS21、BEPS22、BEPS23，其中BEPS21先被離心下來，為白色顆粒狀；隨后得到BEPS22，為黃色顆粒狀；最后得到BEPS23，為淺棕色黏稠狀。經(jīng)去蛋白脫色，再經(jīng)柱層析純化，280 nm處沒有出現(xiàn)吸收峰，收集到的每管均檢測其含糖量，每種粗多糖只出現(xiàn)一個峰，表明獲得的5種多糖均為純品。

2.3 對DPPH自由基的清除作用

由圖5、圖6可知，5種多糖對DPPH自由基均有一定的清除作用，芽孢桿菌xzf1所產(chǎn)的BEPS11和 BEPS12在濃度為15 μg/mL時其清除率分別達(dá)到37.46%和34.58%，都高于維生素C一半的清除率。芽孢桿菌xzf2所產(chǎn)BEPS23在濃度為45 μg/mL時清除率為65.89%，高于維生素C，BEPS22、BEPS21在濃度為15 μg/mL時其清除率分別為34.58%和47.16%。由此可見，5種多糖對DPPH自由基均具有顯著的清除作用。

2.4 對超氧自由基的清除作用

由圖7、圖8可以看出，5種多糖對超氧自由基均有一定的清除作用。芽孢桿菌xzf1所產(chǎn)的BEPS11的清除率在30 μg/mL以下均高于維生素C，最高達(dá)到23.59%；BEPS12在濃度為30 μg/mL時其清除率達(dá)到14.68%。芽孢桿菌xzf2所產(chǎn)的3種多糖在15 μg/mL時其清除率均高于維生素C。BEPS21在濃度為45 μg/mL時其清除率為38.05%，高于維生素C；BEPS22在濃度為90 μg/mL時其清除率為49.95%；BEPS23在濃度為15 μg/mL時其清除率為33.63%。由此可見，5種多糖均能明顯降低鄰苯三酚發(fā)生自氧化的速率，即對超氧自由基有顯著的清除能力。

2.5 對羥自由基的清除作用

由圖9、圖10可見，5種多糖對羥自由基均有一定的清除作用。芽孢桿菌xzf1所產(chǎn)的BEPS11在濃度為75 μg/mL以下時其清除率均高于維生素C，在45 μg/mL時最高，達(dá)42.80%；BEPS12在濃度為75 μg/mL時其清除率最高，達(dá)31.70%。芽孢桿菌xzf2所產(chǎn)3種多糖在濃度為60 μg/mL以下時其清除率均高于維生素C，3種多糖清除率均隨多糖濃度升高而增大，在90 μg/mL時達(dá)到最高，分別為31.81%、34.08%、34.76%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)從家蠅體內(nèi)篩選獲得兩株芽孢桿菌，從菌落形態(tài)觀察得知兩株細(xì)菌產(chǎn)多糖較高。多糖在各領(lǐng)域應(yīng)用價值很高，因而本試驗(yàn)對兩株細(xì)菌所產(chǎn)的5種多糖的分離純化和抗氧化性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，經(jīng)簡單差速離心獲得粗多糖，再通過層析純化和多糖含量檢測，所得多糖皆為純品，表明分步離心方法是一種分離多糖的簡單有效方法。

對5種多糖抗氧化性的研究結(jié)果表明，多糖具有顯著清除DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基的能力。在較低濃度下，很多多糖的清除率高于維生素C，其中，BEPS23在濃度為45 μg/mL時對DPPH自由基的清除率為65.89%；BEPS22在濃度為90 μg/mL時對超氧自由基的清除率為49.95%；BEPS11在濃度為45 μg/mL時對羥自由基的清除率為42.80%?？梢?種多糖均具有很強(qiáng)的抗氧化性，有一定的開發(fā)和應(yīng)用潛力。本試驗(yàn)結(jié)果為抗氧化性多糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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