雞IL—18復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)雞IFN—γ和IL—2表達(dá)的影響

摘要：為探討重組雞白細(xì)胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）與細(xì)胞因子誘生劑聯(lián)合使用對(duì)雞γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）表達(dá)的影響，應(yīng)用不同濃度的雞IL-18重組菌和IL-18蛋白與2-脫氧葡萄糖（2-D-G）和植物血凝素（PHA）組成復(fù)合制劑，分別經(jīng)口服、肌肉注射途徑免疫雛雞，檢測(cè)免疫后不同時(shí)間雞血清中IFN-γ和IL-2含量。結(jié)果顯示，肌肉注射含重組雞IL-18蛋白的復(fù)合制劑能夠明顯提高雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2含量，隨IL-18蛋白量的增加，IFN-γ和IL-2含量有升高趨勢(shì)，且以注射后第7～14天 IFN-γ和IL-2含量最高，分別為43 ng/L和70 ng/L，至少在第28天仍能維持較高水平；經(jīng)口服途徑免疫，含雞IL-18重組菌的復(fù)合制劑也能明顯提高雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2含量，免疫后第7天，IFN-γ和IL-2含量最高，分別為50 ng/L和62 ng/L，之后稍有下降，隨IL-18重組菌量的增加，IFN-γ和IL-2表達(dá)含量變化不大。結(jié)果表明，重組雞IL-18與細(xì)胞因子誘生劑組合，經(jīng)口服或注射途徑免疫，均能顯著提高雞IFN-γ和IL-2含量，為新型免疫增強(qiáng)劑和抗病毒制劑的研究和應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞：雞；白細(xì)胞介素-18（IL-18）；復(fù)合制劑；γ-干擾素（IFN-γ）；白細(xì)胞介素-2（IL-2）

中圖分類號(hào)：R392.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4733-04

雞白細(xì)胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）基因cDNA于2000年由Schneider等[1]首次克隆并在大腸桿菌中成功表達(dá)。中國(guó)于2003年克隆到了長(zhǎng)約500 bp的編碼雞IL-18成熟蛋白基因[2]。2004年，河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共安全實(shí)驗(yàn)室從雞新城疫Ⅰ系病毒接種的雞胚脾細(xì)胞中擴(kuò)增到了雞IL-18全基因[3]，并進(jìn)行了真核表達(dá)和免疫增強(qiáng)作用的研究[4，5]。IL-18具有誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素（IFN-γ）[6]，促進(jìn)CD4+、CD8+細(xì)胞增殖，增強(qiáng)Th1細(xì)胞及NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞毒活性[7]等多種生物學(xué)功能。在抗感染[8]、抗腫瘤[7]、抗寄生蟲(chóng)[9]等方面都具有顯著作用，是目前研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

植物血凝集素是從菜豆屬和金雀花中提取的凝集素，能夠顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖[10]，促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放諸如IFN-γ[11]和IL-2[12]等細(xì)胞因子，可作為輔助免疫增強(qiáng)劑使用。2-脫氧葡萄糖（2-D-G）作為葡萄糖的異構(gòu)體類似物，與病毒的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葡萄糖，且病毒對(duì)兩種異構(gòu)體無(wú)法識(shí)別，致使病毒無(wú)法利用其完成三羧酸循環(huán)，能量代謝受阻，病毒糖蛋白和囊膜合成受阻，無(wú)法正常生長(zhǎng)和復(fù)制，因此，2-脫氧葡萄糖可用于禽類病毒病預(yù)防和治療的輔助性成分。

鑒于目前國(guó)內(nèi)對(duì)于IL-18應(yīng)用的研究主要集中在IL-18蛋白或融合蛋白對(duì)疫苗免疫增強(qiáng)作用，而配合其他免疫增強(qiáng)輔劑對(duì)雞體IFN-γ和IL-2誘導(dǎo)表達(dá)的研究尚不多見(jiàn)。本試驗(yàn)參照植物血凝素（PHA）最小有效劑量[10]和生產(chǎn)實(shí)踐中2-脫氧葡萄糖的使用量，配合不同含量重組雞IL-18，制成復(fù)合制劑免疫雛雞，研究其對(duì)IFN-γ和IL-2誘導(dǎo)表達(dá)的影響，為新型具有免疫增強(qiáng)和抗病毒制劑的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 含雞IL-18基因重組表達(dá)載體的pET28a-ChIL-18的表達(dá)菌，由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共安全實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[13]；PHA購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司， 2-D-G購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，雞IFN-γ ELISA試劑盒（ADL）、IL-2 ELISA試劑盒（ADL）均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)用雞 7日齡非免疫雛雞由非免疫雞胚孵化。

1.2 方法

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 7日齡個(gè)體大小相近的非免疫雛雞330只，隨機(jī)分為口服試驗(yàn)組（A）、注射試驗(yàn)組（B）和對(duì)照組（C，其中C1為空白對(duì)照組，C2、C3為口服對(duì)照組，C4、C5為肌肉注射對(duì)照組），A、B每組各90只，C組150只。按表1進(jìn)行免疫。

1.2.3 雞體IFN-γ和IL-2含量測(cè)定 按表1處理后第7、14、21、28天，各組隨機(jī)取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測(cè)定IFN-γ和IL-2含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 口服試驗(yàn)組IFN-γ和IL-2含量

口服試驗(yàn)組分別于免疫后第7、14、21、28天，各組隨機(jī)取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測(cè)定IFN-γ和IL-2含量，結(jié)果如圖1、圖2。

由圖1可知，口服組免疫后7 d，C2、C3組與C1組IFN-γ含量有明顯差異，A1、A2、A3組與C1、C2、C3組IFN-γ含量差異明顯，增加IL-18含量對(duì)提升雞群體內(nèi)IFN-γ含量無(wú)明顯效果；免疫后14 d，A1、A2、A3組與C1、C2、C3組IFN-γ含量有明顯差異并至少可延續(xù)到第28天，而A1、A2、A3組間無(wú)明顯差異；說(shuō)明IL-18與輔劑配合使用有明顯效果，經(jīng)口服途徑增加IL-18效果不明顯。

由圖2知，口服組免疫后7 d，A1、A2、A3與C1、C2、C3組IL-2有明顯差異，試驗(yàn)A1、A2、A3組間無(wú)明顯差異，說(shuō)明口服途徑提升IL-18含量對(duì)雞群體內(nèi)IL-2含量無(wú)明顯影響；免疫后第14天，A1組與C1組有明顯差異，A2、A3組與C1組有明顯差異，A1、A2、A3與C2、C3組差異明顯，說(shuō)明該階段雞群血清中IL-2含量仍顯著高于未免疫組，且其能較長(zhǎng)時(shí)間維持在高水平狀態(tài)。

2.2 肌肉注射試驗(yàn)組IFN-γ和IL-2含量

肌肉注射試驗(yàn)組分別于免疫后第7、14、21、28天，各組隨機(jī)取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測(cè)定IFN-γ和IL-2含量，分別見(jiàn)圖3、圖4。

由圖3可知，肌肉注射免疫后第7天，C4、C5組與C1組有明顯差異，B1、B2、B3組與C4、C5組有明顯差異；免疫后14 d，B1、B2、B3組間無(wú)明顯差異；免疫后第21天，肌肉注射B3組與各組均有明顯差異，說(shuō)明提升IL-18含量具有明顯增強(qiáng)雞IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)的效果。

由圖4可知，肌肉注射免疫后第7天，B1、B2、B3組與C1、C4、C5組有明顯差異，而B(niǎo)3組也與B1、B2組有明顯差異，說(shuō)明肌肉注射途徑增加IL-18可以明顯提高雞群血清中IL-2含量；乃至處理后第28天，B3組與B1、B2組仍有明顯差異，表明B3組可明顯提升機(jī)體內(nèi)IL-2含量，且其能較長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平狀態(tài)。

3 小結(jié)與討論

IL-18是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化、誘生IFN-γ等生物學(xué)功能。由IFN-γ介導(dǎo)的非特異性免疫反應(yīng)較體液免疫和細(xì)胞免疫早數(shù)小時(shí)至數(shù)天，能為抵御病毒侵害提供快速而強(qiáng)大抵抗力[14]；IFN-γ在機(jī)體內(nèi)含量的高低預(yù)示著動(dòng)物的免疫水平狀況。IL-2的主要作用是促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞分化成熟并激活其生物學(xué)活性，比較IFN-α、IL-1α、IL-2和IFN-γ對(duì)疫苗的免疫增強(qiáng)作用，表明IL-2與IFN-γ的免疫增強(qiáng)效果較強(qiáng)[15]。

IL-18作為天然活性蛋白，克服了使用傳統(tǒng)藥物副作用大的缺點(diǎn)，是一種新型免疫增強(qiáng)劑。PHA和2-D-G也是常用的細(xì)胞因子誘生劑和抗病毒制劑，PHA可刺激T細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞分泌產(chǎn)生干擾素殺傷病毒，細(xì)胞毒T細(xì)胞可直接殺傷病毒；PHA同時(shí)可刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞然后增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生大量的非特異性抗體來(lái)中和病毒。2-D-G作為葡萄糖的異構(gòu)體類似物，干擾病毒能量代謝，可用于禽類病毒病防治的輔助性藥物。由于PHA或2-D-G小劑量單獨(dú)使用效果不佳，增加劑量成本過(guò)高甚至產(chǎn)生毒副作用[16]，這就決定PHA和2-D-G常作為輔劑使用[10，17]。

本試驗(yàn)利用不同劑量的重組雞IL-18菌體和純化蛋白與PHA最小有效量[10]和生產(chǎn)實(shí)踐中2-脫氧葡萄糖最小使用量進(jìn)行組合，分別經(jīng)消化道投送和注射途徑免疫，兩種途徑在免疫早期都能夠明顯提高雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2水平。利用菌體消化道投送，隨著IL-18菌體含量的增加，雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2的水平變化較小，維持的時(shí)間也相對(duì)較短。雖然目前對(duì)復(fù)雜蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物活性存有爭(zhēng)議，但菌體消化道投送途徑表現(xiàn)出IL-18對(duì)雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2具有明顯的誘生作用。有資料表明[18]，在胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、枯否細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞中均可檢測(cè)到IL-18的mRNA，但在小腸上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中有大量的IL-18，表明小腸上皮細(xì)胞可能是IL-18最主要的來(lái)源，并對(duì)IL-18具有翻譯后的加工能力。推測(cè)含IL-18的菌體在消化道被裂解后，菌體表達(dá)的IL-18可被小腸上皮細(xì)胞吸收并進(jìn)行加工修飾而體現(xiàn)出免疫增強(qiáng)活性。

經(jīng)注射途徑免疫，隨著IL-18蛋白含量的增加，雞體內(nèi)IFN-γ和IL-2的水平隨之升高，試驗(yàn)組組間差異明顯，且維持的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，并且IFN-γ和IL-2表達(dá)峰值也較口服途徑稍高。表明增加IL-18蛋白含量，不但可進(jìn)一步提升對(duì)雞體細(xì)胞因子的誘生作用，而且與PHA和2-D-G協(xié)同作用也更明顯。大腸桿菌表達(dá)的IL-18蛋白表現(xiàn)出的誘生活性，與雞體對(duì)重組IL-18蛋白的識(shí)別有關(guān)。

IL-18作為天然的免疫調(diào)節(jié)劑和疫苗免疫增強(qiáng)劑，本身無(wú)免疫原性，不會(huì)引起自身免疫疾病，與PHA和2-D-G聯(lián)合使用，克服了單獨(dú)使用成本高、副作用大等缺點(diǎn)，可作為一種新型復(fù)合免疫調(diào)節(jié)制劑。隨著研究的進(jìn)一步深入，有望為新型免疫增強(qiáng)和抗病毒制劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供新的思路。

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