羔羊卵母細胞體外胚胎生產(chǎn)影響因素分析

摘要：利用幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)能夠獲得大量卵母細胞，縮短世代間隔，加快育種進程。但幼畜卵母細胞形態(tài)及代謝與成年動物存在差異，這導(dǎo)致幼畜胚胎發(fā)育能力低。目前，對JIVET技術(shù)的研究主要是通過改進激素處理方案及體外培養(yǎng)條件來增加卵母細胞數(shù)量并增強卵母細胞發(fā)育能力。從供體羔羊的選擇、激素處理和卵母細胞的發(fā)育等方面對該技術(shù)進行了分析。

關(guān)鍵詞：幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)；羔羊；卵母細胞

中圖分類號：S826；S814.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4726-04

幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)是集幼畜超數(shù)排卵、卵母細胞的體外成熟和體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植為一體的高新技術(shù)體系。利用JIVET技術(shù)能夠獲得大量卵母細胞，縮短優(yōu)良母畜繁殖的世代間隔，加快品種培育的進程[1]。與傳統(tǒng)的綿羊超數(shù)排卵和胚胎移植（MOET）方案相比，由于生產(chǎn)體外胚胎的卵母細胞供體母畜的年齡提前到8～12周齡，故生產(chǎn)后代羔羊的世代間隔縮短為6個月，同時還大大增加了后代數(shù)量，繁殖效率成倍提高。此外，JIVET技術(shù)結(jié)合性控精液進行后代生產(chǎn)，也能提高基因遺傳率約5%，這為該技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用提供了非常廣闊的應(yīng)用前景。

JIVET技術(shù)應(yīng)用的原理在于羔羊出生后的前2個月卵巢生長較快，卵巢的質(zhì)量在4周齡和8周齡時分別增加了6.8倍和10.8倍，生長卵泡數(shù)量在4周齡時顯著增加[2]。生長卵泡數(shù)量和卵巢的質(zhì)量在8～12周齡時下降，一直持續(xù)到33周齡[2]。卵泡在4周齡時出現(xiàn)閉鎖信號，在8～10周齡時達到最大值[3]。這些結(jié)果顯示3～8周齡時卵泡生長旺盛，能搜集到大量的未閉鎖卵母細胞。研究表明，羔羊?qū)ν庠创傩韵偌に仄鸱磻?yīng)，但部分羔羊?qū)に夭幻舾衃3]。與成年羊相比，羔羊胚胎體外培養(yǎng)時以及移植到受體后的發(fā)育能力都很低[4]，這導(dǎo)致胚胎移植后胎兒流產(chǎn)和畸形率高[5]，極大地制約了JIVET技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用。而通過選擇適當(dāng)?shù)募に靥幚矸桨负腕w外胚胎生產(chǎn)體系能顯著提高3～4周齡羔羊生產(chǎn)后代的能力[6，7]。目前研究表明，影響JIVET效率的因素主要包括供體的選擇、超排方案和卵母細胞的發(fā)育能力等[8，9]。本文就羔羊JIVET技術(shù)的影響因素進行系統(tǒng)分析。

1 供體羔羊的選擇

理想的供體羔羊在激素處理后將產(chǎn)生大量的卵泡和高發(fā)育能力的卵母細胞。影響供體羔羊選擇的因素包括遺傳背景、年齡等。

1.1 遺傳背景

羔羊遺傳背景主要包括品種、基因型和個體差異等。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，成年后排卵數(shù)高的綿羊品種性成熟前卵巢和卵泡發(fā)育滯后于成年后排卵數(shù)低的品種，且前者對激素的敏感性低于后者[10，11]。Sonjaya等[12]對剛出生的羔羊卵巢進行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)法蘭西（成年后排卵數(shù)低）各級卵泡數(shù)比羅姆尼（成年后排卵數(shù)高）多，且前者各級卵泡直徑大于后者。4周齡時，法蘭西3級卵泡數(shù)量多于羅姆尼，且前者直徑大于后者。外源激素分別處理4周齡羔羊，能夠誘導(dǎo)法蘭西羔羊排卵，而羅姆尼不反應(yīng)。白佳樺[10]用相同激素處理方法處理幾個品種的羔羊，平均每只羔羊采集到的卵母細胞數(shù)排卵數(shù)高的品種顯著低于排卵數(shù)低的品種。多胎基因FecB能夠影響羔羊卵泡發(fā)育，3月齡不攜帶FecB基因的布魯拉羊（Booroola）比攜帶FecB基因的布魯拉羊擁有更多的大卵泡[11]。Ptak等[13]發(fā)現(xiàn)一只羔羊卵母細胞具有很高的發(fā)育能力，其生產(chǎn)的5只同胞羔羊的卵母細胞同樣具有很高的發(fā)育能力，這說明基因型一致的羔羊卵母細胞發(fā)育能力也趨于一致。

1.2 供體年齡

不同年齡段羔羊激素處理后卵巢反應(yīng)不同。Armstrong[14]認為激素處理羔羊的最佳年齡為4～6周齡，因為此時大部分卵泡處于應(yīng)答狀態(tài)。O’Brien等[15]指出，3～6周齡羔羊卵母細胞超排效果好于16～24周齡羔羊。Morton等[6]用激素處理不同年齡（3～4周齡和6～7周齡）羔羊，發(fā)現(xiàn)羔羊年齡影響到子宮質(zhì)量，但對卵巢質(zhì)量、卵泡數(shù)量和獲得的卵母細胞數(shù)量沒有影響。然而，6～7周齡羔羊卵母細胞囊胚率（27.9%）高于3～4周齡羔羊（20.4%），證明羔羊隨著年齡的增長其卵母細胞發(fā)育能力增強。盡管如此，年輕的羔羊（4～6周齡）激素處理效果和最終獲得的后代數(shù)顯著高于年長的羔羊。

2 激素誘導(dǎo)應(yīng)答

幼畜對激素的應(yīng)答個體差異很大[5，13]。Ptak等[13]發(fā)現(xiàn)50%～72%的2～7月齡羔羊?qū)に胤磻?yīng)（卵泡數(shù)量和大小）不明顯。相反，Morton等[6]發(fā)現(xiàn)所有3～4周齡羔羊卵巢對激素應(yīng)答，其中24%應(yīng)答弱，44%應(yīng)答中等，32%應(yīng)答強；對6～7周齡羔羊的試驗結(jié)果也相差不大。Ptak等[5，13]發(fā)現(xiàn)對激素應(yīng)答弱的羔羊卵母細胞體外培養(yǎng)后不能發(fā)育至囊胚。相反，Morton等[6]發(fā)現(xiàn)3～4周齡和6～7周齡羔羊卵巢激素應(yīng)答弱的卵母細胞具有發(fā)育到囊胚的能力。然而，激素應(yīng)答弱和應(yīng)答中等的羔羊卵巢其可用卵母細胞百分比無顯著差異，但高于激素應(yīng)答強的羔羊。3～4周齡羔羊不同激素應(yīng)答強度的卵母細胞卵裂率和囊胚率無顯著差異；但6～7周齡羔羊激素應(yīng)答強的卵母細胞卵裂率低[6]。激素處理方案的改變使更多的羔羊?qū)に貞?yīng)答，提高了JIVET效率。選擇適當(dāng)?shù)募に靥幚矸椒苁勾蟛糠指嵫驊?yīng)答明顯。

3 激素處理方法

激素處理羔羊能增加卵巢中可用卵泡數(shù)量，并獲得大量卵母細胞[6，15]。激素處理后羔羊卵母細胞發(fā)育速度加快[6，15]。幼畜卵巢對激素應(yīng)答及卵母細胞發(fā)育能力增強的確切機制還不清楚。激素應(yīng)答過程伴隨著卵泡變大及卵母細胞生物合成反應(yīng)的進行[14]，為卵母細胞受精后的發(fā)育做準備。激素處理后，羔羊卵泡細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)和卵泡內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[15]。例如，誘導(dǎo)顆粒細胞內(nèi)促性腺激素受體的形成，促使卵泡對促性腺激素反應(yīng)能力增強，從而提高卵母細胞質(zhì)量和功能。羔羊超數(shù)排卵的激素用法一般參照成年羊超排方案，即促性腺激素法或孕酮結(jié)合促性腺激素法。

3.1 促性腺激素法

單次或多次注射促卵泡成熟激素（FSH）不能影響每只羔羊采集的卵母細胞數(shù)量[5，16]。然而，多次FSH處理能提高卵母細胞發(fā)育到囊胚的能力[5，17]。羔羊超數(shù)排卵的激素用量低于成年綿羊，因為羔羊體重低于成年羊且羔羊卵泡對激素非常敏感[2]。但相比成年動物，低劑量促性腺激素造成激素與卵母細胞結(jié)合的量減少，這就造成卵母細胞體外成熟時發(fā)育能力減弱。研究表明大劑量促性腺激素能提高幼畜卵母細胞細胞質(zhì)成熟能力。目前，羔羊JIVET的最佳FSH劑量為130～160 mg[6，17，18]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）不能增加羔羊超數(shù)排卵后采集的卵母細胞數(shù)量，但能提高其囊胚率[17，18]。目前報道的能顯著提高卵母細胞囊胚率的超排方法是每隔12 h注射1次FSH（40 mg/次），連續(xù)注射4次，最后1次注射FSH時同時注射500 IU eCG，在第一次注射FSH后48 h采集卵母細胞[17]。

3.2 孕酮+促性腺激素法

促性腺激素和孕酮一起使用能增加幼畜超排的卵母細胞數(shù)量和體外發(fā)育能力[6，15]。孕酮處理7 d后停藥，卵巢上可見卵泡比未用藥前多了2倍[16]。然而，停藥后卵母細胞處于不同的成熟期，說明孕激素處理雖然增加了卵泡的數(shù)量，但降低了卵母細胞質(zhì)量。且孕激素處理后再注射FSH與僅注射FSH相比沒有影響采集到卵母細胞數(shù)量。

4 幼畜卵母細胞形態(tài)和代謝特點

研究表明，幼年動物和成年動物卵母細胞的細胞器在形態(tài)上存在明顯不同。比如，同期幼年動物卵母細胞比成年動物卵母細胞的直徑小，但GV期時其胞質(zhì)細胞器（如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴）形態(tài)和成年動物相似[19]。而幼年動物放射冠細胞觸角比成年動物少，體外成熟時皮質(zhì)顆粒遷移延遲[16]。

卵母細胞成熟時蛋白質(zhì)的合成依靠卵母細胞和卵丘細胞相互作用，這是卵母細胞減數(shù)分裂及胚胎正常發(fā)育的前提[20]。體外成熟過程中卵母細胞攝入的氨基酸[21-23]及合成的蛋白質(zhì)[23]很少，幼年動物卵母細胞蛋白質(zhì)合成峰值出現(xiàn)的時間與成年動物不同[23]，這是因為卵丘-卵母細胞間相互作用存在缺陷[21，22]。此外，幼年動物卵母細胞內(nèi)成熟促進因子（MPF）合成水平和構(gòu)象與成年動物相似，但成熟后幼年動物卵母細胞MPF活性低于成年動物[22]。

幼年動物卵母細胞代謝也不同于成年動物。體外成熟過程中幼年動物卵母細胞谷氨酰胺代謝水平低于成年動物，葡萄糖和丙酮酸代謝水平和成年動物相似。以上結(jié)果表明幼年動物卵母細胞形態(tài)、代謝和超微結(jié)構(gòu)與成年動物有所不同，但這些研究所用的羔羊年齡范圍大（40 d至6個月），且所用的激素處理方案不同，這些可能影響到試驗結(jié)果。

5 幼年動物卵母細胞的體外發(fā)育潛力

與成年動物卵母細胞相比，幼年動物卵母細胞成熟時減數(shù)分裂速率相差不大[22]， 且幼年動物卵母細胞體外生產(chǎn)的囊胚在形態(tài)上無差別，其總細胞數(shù)[23，24]及內(nèi)細胞團細胞數(shù)與總細胞數(shù)比率[23，24]差異不顯著，但其異常受精率高[22，23]且囊胚率低[13，17]。目前一般將這種情況歸結(jié)于細胞質(zhì)成熟的紊亂。細胞質(zhì)成熟紊亂會造成受精異常，不能形成正常的雄原核，不能阻止多精入卵，阻止受精卵繼續(xù)發(fā)育。最終造成胚胎基因組表達異常，預(yù)附植時胚胎丟失，附植后胚胎發(fā)育失敗[14]。不僅胚胎成活率低，胎兒丟失率[5，13，15]和木乃伊化比率[5]也高。Ptak等[25]報道稱妊娠中斷發(fā)生在妊娠第40～60天，胎兒丟失發(fā)生在妊娠第80～100天，僅僅6%胚胎能發(fā)育并完成整個妊娠期。

6 小結(jié)與展望

限制JIVET技術(shù)商業(yè)化的因素包括幼畜對激素的反應(yīng)不穩(wěn)定、卵母細胞發(fā)育能力低等。但通過使用高劑量FSH能誘導(dǎo)所有羔羊卵巢發(fā)育[6]。品種和基因型也會影響幼畜超數(shù)排卵效果[17，18]。目前，有學(xué)者研究的羔羊卵母細胞發(fā)育能力和成年羊沒有區(qū)別，且移植后妊娠率高[17，18，26]。所以通過選育特定基因型通過JIVET技術(shù)育種或許是一個不錯的選擇。

基因組學(xué)能讓我們更深入地研究成年動物和幼年動物的區(qū)別。目前已發(fā)現(xiàn)幼畜胚胎內(nèi)幾種重要的發(fā)育相關(guān)基因的表達與成年動物不同[27，28]。Ptak等[25]發(fā)現(xiàn)羔羊胚胎移植后胎兒發(fā)育停滯是由于全基因組甲基化水平低造成的。這些基因表達水平上的研究將使我們更深入地了解幼年動物和成年動物卵母細胞和胚胎的差異，為進一步改進幼畜胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)提供理論支持。

目前，幼畜胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進步，Kelly等[18]進行羔羊胚胎體外生產(chǎn)并移植，平均每只供體羔羊能生產(chǎn)16只羔羊后代。而隨著幼畜胚胎體外生產(chǎn)效率的不斷提高，該技術(shù)也將為優(yōu)良家畜繁育及新品種培育等領(lǐng)域提供更加廣闊的應(yīng)用前景。

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