采前殼聚糖處理對厚皮甜瓜果實相關防御性酶活性的影響

摘要：采用1 g/L的殼聚糖分別在“銀帝”甜瓜（Cucumis melo L.）開花前1周、幼果期、果實膨大期、網紋形成期對植株進行噴灑。結果表明，采前殼聚糖處理可有效提高甜瓜果實采后相關防御性酶的活性。隨著處理次數(shù)的增加，多酚氧化酶（PPO）、幾丁質酶（CHT）活性先上升后下降。病程相關蛋白β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性增加，過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性提高，總的看來，以累積處理4次的甜瓜果實防御性酶活性增加較為明顯。

關鍵詞：甜瓜（Cucumis melo L.）；殼聚糖；采前處理；防御性酶

中圖分類號：S652；S436.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4679-04

“銀帝”是甘肅省近年來主要推廣的厚皮甜瓜（Cucumis melo L.）品種，其品質優(yōu)良，但采后貯運性欠佳，腐爛頗為嚴重，致腐病原物可在采前和采后侵染果實[1]。通過誘導甜瓜果實產生抗病性來減少腐爛損失已成為目前研究的熱點[2]。殼聚糖作為一種高分子陽離子多聚物，具有抗病毒、抗細菌、抗真菌的作用，廣泛應用于農業(yè)的各個方面，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ恼T導劑[3]。大量研究表明殼聚糖能夠有效誘導植物抗病性[4]。殼聚糖能夠誘導單子葉植物和雙子葉植物均產生防衛(wèi)反應[5，6]，還可以誘導辣椒葉片[7]、冬棗[8]、芒果[9]、臍橙[10]等產生防御性酶，從而使相應的植物產生抗病性。殼聚糖也可影響甜瓜果實品質[11]，對伽師瓜有很好的保鮮效果[12]。

甜瓜體內的抗性酶與甜瓜的抗逆能力密切相關[13]。利用殼聚糖誘導植物產生抗病物質從而提高植物的抗病能力目前報道較多，但通過采前殼聚糖處理甜瓜葉片，誘導甜瓜果實抗性酶的提高尚未見報道。為探明殼聚糖處理甜瓜植株后其果實體內相關抗性酶的變化， 試驗分析研究了殼聚糖采前處理甜瓜葉片后果實過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、β-1，3-葡聚糖酶（GLU）和幾丁質酶（CHT）活性的變化， 并探討了殼聚糖對這些酶類的誘導機理， 以期為殼聚糖在甜瓜防腐的開發(fā)與應用中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

“銀帝”甜瓜種子由甘肅省河西甜瓜研究所提供，果實采自甘肅省民勤縣泉山鎮(zhèn)露地栽培大田，單瓜套發(fā)泡網袋后入紙箱，運抵甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室常溫下貯藏待用。殼聚糖[聚β-（1，4）-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖]為濟南海得貝海洋生物工程有限公司產品（工業(yè)級，n<100），用1%乙酸作為溶劑，調pH至5.6～6.0[14]。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖處理與采樣 分別于甜瓜開花前7 d、幼果期、果實膨大期、網紋形成期對甜瓜植株均勻噴灑1 g/L的殼聚糖（0.05% Tween20作展布劑），以清水處理作對照。每升藥液處理甜瓜45～50株，每處理30株。在幼果期、果實膨大期、網紋形成期和成熟期采樣進行相關指標的測定。

1.2.2 酶的提取及酶活性測定

1）粗酶液的提取。參照張正科等[15]的方法。

2）酶活性測定。過氧化物酶（POD）：參照李合生[16]的方法，以愈創(chuàng)木酚為底物，在470 nm下測定吸光度。酶活性以每分鐘A470 nm變化0.01為一個酶活力單位（U）表示。

多酚氧化酶（PPO）：參照Chen等[17]的方法并做修改，以鄰苯二酚為底物，在420 nm下測定吸光度，以每毫克蛋白每分鐘A420 nm變化0.01為1個酶活力單位（U）表示。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）： 參照Liu等[18]的方法略有改動，以L-苯丙氨酸為底物，在290 nm下測定吸光度值。酶活性以每分鐘A290 nm變化0.01為一個酶活力單位（U）表示。

β-1，3-葡聚糖酶（GLU）：參照Bi等[19]的方法，以1 mg/mL昆布多糖（Sigma公司）為底物， 在660 nm下比色，根據標準曲線求出樣品液中的還原糖量。以每分鐘分解昆布多糖產生還原糖1 nmol的酶量為一個酶活力單位（U）。

幾丁質酶（CHT）：參照Bi等[19]的方法，以CM chitin RBV為底物，在550 nm下測定吸光度值。酶活性以每分鐘A550 nm變化0.01為一個酶活力單位（U）表示。

蛋白含量測定參照Bradford[20]的方法測定， 以牛血清蛋白（BSA）作標準曲線，計算蛋白質含量。計算結果用于表示酶的比活力單位，即上述5種酶（POD、PPO、PAL、GLU、CHT）活力單位最終表示為U/mg蛋白。以上每個試驗都重復3次。

1.2.3 數(shù)據統(tǒng)計 采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據整理與分析；圖表制作采用軟件Excel 2003；t檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 采前殼聚糖處理對甜瓜果實POD活性的影響

從圖1可以看出，殼聚糖處理可顯著提高果實POD活性，甜瓜果實生長發(fā)育過程中POD活性先升高后降低，在網紋形成期POD活性達到最高。不同生長發(fā)育階段的殼聚糖處理可明顯提高果實的POD活性。例如殼聚糖處理3次后，在網紋形成期的POD活性比同期對照高151.91%，分別比處理1、2次高79.20%、36.44%。

2.2 采前殼聚糖處理對甜瓜果實PPO活性的影響

從圖2可以看出，果實在生長發(fā)育過程中PPO活性變化不大，但總體呈上升趨勢。不同生長發(fā)育階段的殼聚糖處理促進了果實PPO活性的提高。例如殼聚糖處理2次后，在膨大期的PPO活性與對照、處理1次相比差異都達到顯著水平（P<0.05），分別比對照、處理1次的高34.35%、14.07%。

2.3 采前殼聚糖處理對甜瓜果實PAL活性的影響

從圖3可以看出，對照的甜瓜果實在生長發(fā)育過程中，PAL活性無明顯變化。處理果實在生長發(fā)育過程中PAL活性呈先上升后下降的趨勢。不同生長發(fā)育階段殼聚糖處理均可促進果實體內PAL活性的提高。例如殼聚糖處理3次后，在網紋形成期的PAL活性達到最大，處理1次和處理2次之間差異顯著（P<0.05），處理3次后高出同期對照89.67%，也分別高出1、2次處理79.89%、14.81%。

2.4 采前殼聚糖處理對甜瓜果實GLU活性的影響

從圖4可以看出，殼聚糖處理可明顯誘導果實GLU活性的提高，對照果實在生長發(fā)育過程中GLU活性呈上升趨勢。不同生長發(fā)育階段的殼聚糖處理可促進果實體內GLU活性明顯上升，且酶活性隨處理次數(shù)的增多而增大。例如殼聚糖處理4次后在成熟期的GLU活性達到最大，高出同期對照92.14%，也分別高出1、2、3次處理62.61%、18.95%、3.95%。

2.5 采前殼聚糖處理對甜瓜果實CHT活性的影響

從圖5可以看出，甜瓜果實CHT活性總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢，對照CHT活性變化趨勢與GLU相同。生長發(fā)育階段的殼聚糖處理也可促進果實CHT活性的提高，于果實網紋形成期達到峰值，之后有所下降。例如經殼聚糖處理3次的果實在網紋形成期CHT的活性分別高于對照、處理1次、處理2次53.83%、36.59%和19.97%。

3 小結與討論

植物次生代謝產物在提高植物自身保護和生存競爭能力、協(xié)調與環(huán)境關系上充當著重要的角色[21]。在植物防御反應的次生代謝中，苯丙烷類代謝是重要的代謝途徑之一，它可形成包括植保素、木質素和酚類化合物等在內的次生抗病物質[22]。殼聚糖處理可促進果實體內POD和PPO活性的積累，該結果與前人在辣椒[7]、冬棗[8]、芒果[9]、臍橙[10]、花生種子[23]上的殼聚糖處理結果基本一致。POD參與活性氧代謝及木質素和木栓質的合成，并催化木質素與細胞壁糖蛋白的共價交聯(lián)[22]。PPO是植保素和酚類物質合成途徑的重要酶，可將酚類物質氧化成高毒性的醌類物質從而可對入侵病原物進行毒殺[24]。采前殼聚糖處理可提高甜瓜果實體內PAL的活性，這與殼聚糖處理楊樹[4]、太子參[25]后其葉片PAL活性顯著增高結果一致。PAL是植物次生代謝的關鍵酶之一，它催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，這個過程涉及到很多保護性物質的合成，如植物體木質素和酚類物質的加速合成和積累、植物細胞壁的木栓化，PAL活性與植物的抗病性也密切相關[26]。

殼聚糖處理明顯促進果實體內GLU和CHT活性的積累，并且處理次數(shù)越多誘導效果越明顯。這一結果與劉鋒等[27]殼聚糖處理誘導臍橙GLU和CHT活性升高的結論相似。GLU和CHT是兩類重要的病程相關蛋白，這兩種酶活性的提高是植物抗逆性增強的表現(xiàn)，是植物建立系統(tǒng)抗病性的標志酶[28]。GLU和CHT作用的底物是β-1，3-葡聚糖和幾丁質，而這兩種物質是真菌細胞壁的主要組成物質，兩種酶具有協(xié)同殺菌的作用，當二者協(xié)同表達時，植物可以顯現(xiàn)出較強的抑菌活性[29]。殼聚糖處理有利于提高發(fā)育過程中甜瓜果實抗逆性和抗病性，甜瓜在發(fā)育過程中形成并增強的抗性系統(tǒng)并沒有因為果實的成熟而喪失。

試驗結果表明，殼聚糖處理能誘導甜瓜果實體內POD、PPO、PAL、GLU和CHT等抗性相關酶活性的提高。殼聚糖采前處理對甜瓜果實抗病性的誘導會由于誘導時間和次數(shù)不同而效果不同，總的來說，在網紋形成期誘導抗病效果最好，處理4次效果最明顯。殼聚糖作用效果受其脫乙酰度、分子量、濃度等的影響，試驗僅選取了單一濃度對厚皮甜瓜進行了抗性分析，如果選取不同條件組合的殼聚糖處理，是否可以取得更好的誘導效果，還需要進一步探討。

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