旱稻65及其雜交后代的RAPD分析

摘要：利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）從分子水平檢測旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）及雜交后代間的遺傳差異。采用20對隨機引物對兩者基因組DNA進行RAPD-PCR擴增。結果表明，RAPD共擴增出159個位點，其中多態(tài)性位點有33個，占總位點的20.75%。旱稻65和雜交后代之間存在RAPD多態(tài)性，表明旱稻65和雜交后代之間DNA水平存在差異。

關鍵詞：旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）；雜交后代；隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）；聚合酶鏈式反應式（PCR）

中圖分類號：S511.3+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4519-03

隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術是建立在PCR（Polymerase chain reaction）基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術，廣泛應用于大豆（Glycine max）[1]、玉米（Zea mays）[2]、番茄（Solanum lycopersicum）[3]等生物的品種鑒定、系譜分析及進化關系的研究上。RAPD在旱稻研究中具有廣泛的應用，旱稻的種質資源鑒定、遺傳多樣性、遺傳改良研究等都與RAPD標記有關[4，5]。

旱稻是通過人工選擇培育而來可適應無水層土壤條件的生態(tài)型稻，具有耐旱性強、需水量少等特點，是進行作物抗旱遺傳改良的寶貴種質資源，是推行節(jié)水農業(yè)、旱作農業(yè)的最佳旱糧作物之一[6]。加強旱稻種質資源保護，挖掘抗旱基因資源，加快傳統(tǒng)旱稻品種的遺傳改良，對緩解當前水資源短缺具有重要意義。趙鳳梧等[7]通過將高光效、高抗性的C4植物稗草作為父本與旱稻65進行兩屬雜交，后代F5與高粱進行三屬雜交，得到穩(wěn)定遺傳的后代。雜交后代光合效率及抗逆性狀均有明顯提高，并從同工酶及AFLP水平對試驗材料進行了研究，證實了后代中確有優(yōu)良性狀基因的存在[8，9]。本研究選用旱稻65及旱稻/稗草//高粱的三系雜交后代（以下簡稱雜交后代）為材料，通過20對隨機引物分別對其基因組DNA進行RAPD分析，為旱稻種質鑒定及新品種選育等方面提供一定的分子生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

旱稻65及雜交后代種子由河北省農科院旱作農業(yè)研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物組織材料的培養(yǎng) 選取飽滿度一致的旱稻65及雜交后代種子各50多粒，0.1%氯化汞消毒10 min，蒸餾水沖洗5次，放于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中浸種發(fā)芽，待長至1周后選取幼嫩葉片進行基因組DNA提取。

1.2.2 基因組DNA的提取 旱稻65及雜交后代基因組DNA提取采用CTAB法[10]提取。

1.2.3 RAPD-PCR擴增 RAPD引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的隨機引物S1-S20。20 μL反應體系包括：10×PCR Buffer 2 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL， RAPD引物2 μL， DNA（30 ng）4 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/mL）1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，45個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。RAPD產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳， 溴化乙錠染色，紫外凝膠成像儀掃描觀察。

2 結果與分析

2.1 旱稻65及雜交后代基因組DNA檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳對旱稻65及雜交后代基因組DNA進行檢測（圖1），所提取的基因組DNA條帶較清晰，很少有降解，符合RAPD擴增要求，可用于PCR分析。

2.2 旱稻65及雜交后代的RAPD分析結果

通過20對隨機引物對旱稻65及雜交后代進行RAPD分析（圖2、圖3）。由圖2、圖3可以看出，除了引物S2引物對雜交后代（S2-Z）未擴增出條帶，其余19對引物均對兩個品種擴增出不同長度的條帶，并且擴增片段大都分布在0.1～2.0 kb之間。同時在擴增的條帶中，除了S4、S7、S12、S17和S20引物對兩個品種的擴增條帶沒有明顯區(qū)別外，其余15對引物均可擴增出長度或亮度不一的特異條帶。

2.3 旱稻65及雜交后代的多態(tài)性位點

多態(tài)性的引物RAPD擴增共得到159條帶，其中多態(tài)性條帶33條，多態(tài)性程度為20.75%。每個引物可擴增出1～5條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶為1.56。此外，不同隨機引物對旱稻65及雜交后代的擴增條帶有很大不同。由表1可知，引物S3、S8、S9、S10、S11，S15、S16的多態(tài)性條帶只有1條，引物S14、S18的多態(tài)性條帶有2條，而引物S2有5條多態(tài)性條帶。有些引物雖然擴增的總帶數(shù)多，但多態(tài)性條帶比例較少，如引物S4和S7基本沒有多態(tài)性條帶出現(xiàn)。有些引物雖擴增出的總帶數(shù)少，但多態(tài)性條帶比例較多，如引物S2擴增的總條帶數(shù)為5，但是多態(tài)性條帶比例可達100%。有些引物擴增出的總帶數(shù)和多態(tài)性條帶比例均較低，如引物S16擴增出的總帶數(shù)為5，多態(tài)性條帶比例只有20%。

3 小結與討論

利用RAPD技術對旱稻65及雜交后代進行分析發(fā)現(xiàn)，除了引物S2對雜交后代未擴增出任何條帶外，其他引物均可擴增出大小不一的特異條帶。從總的擴增水平來看，旱稻65及雜交后代呈現(xiàn)不同的擴增多態(tài)性，但兩者整體多態(tài)性偏低，多態(tài)性程度僅為20.75%。雜交后代是以旱稻65為母本進行多次雜交而產生，因此在基因組水平上可能存在很大的一致性，這也是導致兩者多態(tài)性偏低的重要原因。但從對兩者生理水平的研究發(fā)現(xiàn)，雜交后代在多個參數(shù)中均優(yōu)于旱稻65。經(jīng)過多次雜交后，雖然兩者在基因組水平上差異有限，卻可導致雜交后代生理上的優(yōu)越性，表明通過雜交可以將稗草和高粱中的優(yōu)良基因導入旱稻65中，最終產生了具有較好抗逆性的雜交后代。因此，可以將穩(wěn)定的差異條帶進行克隆、鑒定及分析，篩選較好的抗逆基因，為轉基因研究奠定基礎。

同時發(fā)現(xiàn)，在統(tǒng)計多態(tài)性條帶時不能只以條帶的有無來判斷，實際上很多擴增條帶的強弱也可反映DNA水平的變化，同時也可作為差異來統(tǒng)計。由于RAPD標記是從分子水平上揭示種質間的遺傳差異，比傳統(tǒng)的遺傳標記準確度要高，因此，通過結合不同的分子標記方法，為選育雜交新品種提供一定的理論依據(jù)，為更好指導現(xiàn)代稻作育種提供便利。

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