R2工程細菌纖維素酶酶活影響條件初探

摘要：以3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定纖維素酶活力，研究了不同濃度的表面活性劑（Tween 80）、不同緩沖液、不同pH對R2工程細菌纖維素酶酶活的影響。結果表明，在35 ℃、Tween 80濃度為1.6%、醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 4.8的條件下纖維素酶酶活最高， 是對照的1.47倍。

關鍵詞：纖維素酶；Tween 80；pH；表面活性劑；緩沖體系

中圖分類號：Q935 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4486-03

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，也是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物[1]。纖維素是經(jīng)β-1，4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈高分子，具有很強的結晶性，糖苷鍵能通過酶的催化作用發(fā)生水解。可以通過纖維素酶系來分解纖維素，使之轉變?yōu)榭杀焕玫腄-葡萄糖，再進一步發(fā)酵為酒精，對開發(fā)新能源具有重要的意義[2]。

纖維素酶酶解反應過程主要受到溫度和pH[3，4]等多方面因素的影響，同時表面活性劑可以使高分子聚合物變成復雜的親水性化合物，使纖維素與纖維素酶有效結合，從而提高纖維素酶的酶解效率[5-7]。試驗將表面活性劑、緩沖液和pH對纖維素酶酶活的影響進行了研究，以期得到纖維素酶適宜的酶解條件，更高效地轉化和利用纖維素。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

卡那霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、Tween 80、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、苯酚、CuSO4·5H2O、CaCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、葡萄糖均為分析純；R2工程細菌由重慶理工大學藥學與生物實驗室提供[8]。

TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；UV-2450紫外可見光光度計（優(yōu)尼科儀器有限公司）；C型玻璃儀器氣流烘干器（長城科工貿有限公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BS110S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（上海越眾儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 R2工程細菌纖維素酶的分離純化 將R2工程細菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后經(jīng)IPTG誘導，將誘導后的培養(yǎng)液于5 ℃、5 000 r/min離心30 min，收集沉淀，往沉淀中加入10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 4.8），超聲波破碎（功率300 W，間歇5 s，99次）。取一小滴菌液于載玻片上，草酸銨結晶紫染液染色，顯微鏡下觀察破碎情況，直至無完整細胞。將完全破碎后的菌液裝入離心管，5 ℃， 3 000 r/min離心15 min，上清液于-20 ℃保存[9，10]。

1.2.2 纖維素酶的鑒定和酶活的測定 CMC培養(yǎng)基鑒定纖維素酶[11]。DNS法測定纖維素酶活[12]。一個酶活力單位（U）定義為45 ℃、pH 4.8的條件下，每分鐘催化CMC水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.2.3 纖維素酶酶活最適緩沖液及pH的確定[12] 用醋酸-醋酸鈉緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制1%的CMC溶液。在各試管中加入1.5 mL對應的1%的CMC溶液，再加入0.5 mL“1.2.1”中提取的酶液，用2 mL 1%的CMC溶液作對照；40 ℃水浴40 min后立即加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入5 mL去離子水，冷卻后測定吸光度。

1.2.4 纖維素酶最適溫度的測定 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，在不同溫度（15、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃）反應30 min，加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入10 mL去離子水，冷卻后測吸光值。

1.2.5 纖維素酶酶活最適Tween 80濃度的確定[13] 取“1.2.1”中提取的酶液0.5 mL，加入CMC底物1.5 mL，再加入0.1 mL不同濃度的Tween 80溶液，45 ℃反應30 min后加入3 mL DNS試劑，沸水浴7 min后加入10 mL去離子水，冷卻后測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據(jù)羧甲基纖維素酶活力測定方法測定溶液中還原糖（葡萄糖）的含量，并以吸光值為縱坐標、葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線（圖1）。標準曲線決定系數(shù)r2=0.994 8，可以用于纖維素酶活力的測定。

2.2 不同緩沖液及pH對纖維素酶酶活的影響

從圖2可以看出，隨著pH的升高纖維素酶酶活呈先上升后下降的趨勢，合適的pH在4.0～5.5之間，最適pH為4.8，過酸、過堿的環(huán)境會影響酶和底物的穩(wěn)定性，導致纖維素酶活性的降低。醋酸-醋酸鈉緩沖液為較適緩沖液。

2.3 溫度對纖維素酶酶活的影響

從圖3可以看出，R2工程細菌纖維素酶的活性先隨著溫度的升高逐漸增加，當達到35 ℃時纖維素酶的活力達最大，而后隨著溫度的升高酶活力下降。故酶活最適溫度選擇35 ℃。

2.4 不同濃度Tween 80對纖維素酶酶活的影響

從圖4可以看出，R2工程細菌纖維素酶酶活在Tween 80濃度為1.6%時達到最大，是對照（無Tween 80和緩沖液體系）的1.47倍。在較低濃度時，隨著Tween 80濃度的增加纖維素酶酶活增強。Tween 80可以減弱發(fā)酵液的表面張力，纖維素被疏水基團包圍，使纖維素高分子聚合物變成復雜的親水性化合物，從而加強纖維素與纖維素酶的有效結合，提高纖維素酶的酶解效率。當酶活達到最大值后，隨著Tween 80濃度的增加，可能使纖維素高分子聚合物被更多的表面活性物質包被，從而減少了纖維素與纖維素酶的接觸機會，酶活逐漸降低。

3 小結

試驗以DNS法測定了R2工程細菌纖維素酶活力，研究了不同溫度、不同濃度表面活性劑Tween 80、不同緩沖液及pH對纖維素酶酶活的影響，結果表明，在35 ℃ Tween80濃度為1.6%、醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 4.8的條件下纖維素酶酶活最高， 是對照的1.47倍。

表面活性劑能夠使大分子聚合物的復雜空間立體結構發(fā)生變化，如纖維素是被疏水基團包圍，難溶于水，較高的表面活性使纖維素高分子聚合物變成復雜的親水性化合物，因此，纖維素酶可以方便地吸附底物，從而表現(xiàn)出酶活的增加。但是隨著表面活性劑Tween 80濃度的不斷增加，會使表面活性劑與纖維素酶之間的電荷積累而相互排斥，也可能因為表面活性劑與纖維素相互吸附降低了酶與底物的吸附從而使酶活下降。

在當今環(huán)境污染嚴重、能源緊缺的情況下，將纖維素酶反應體系擴大應用于工業(yè)化生產，把纖維素轉化生成葡萄糖或酒精，能夠提供重要的工業(yè)原料和能源物質，這對開辟新原料、新能源物質具有重要的理論和實踐意義。

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